防己茯苓汤抗炎组分筛选及其机制分析

潘一峰， 杨晓露， 刘 朵， 章丹丹*

(1.上海现代中医药股份有限公司，上海200050;2.上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海201203)

防己茯苓汤出自张仲景所著《金匮要略》之水气病脉证篇:防己、黄芪、桂枝各三两，茯苓六两，甘草二两，以上五味，以水六升，炙取二升，分温三服。具有益气健脾，温阳利水的功效［1］。现代临床应用广泛，主要用于治疗慢性肾炎水肿、心脏病水肿、肝硬化腹水等水肿类疾病，还可辅助治疗慢性胃炎、慢性结肠炎、慢性滑膜炎等［2-4］。其在多种动物模型上呈抗炎效果，能抑制二甲苯致小鼠耳肿胀和大鼠蛋清性足肿胀，抑制大鼠棉球性肉芽增生，降低大鼠毛细血管通透性，降低角叉菜致大鼠趾肿组织中的前列腺素含量［5］。但其抗炎的活性组分及其分子机制尚未完全确定和阐明。

本实验利用水煎和乙醇提取分别获得防己茯苓汤水或醇提取物和组成方剂的单味药醇提取物，再利用有机溶剂萃取将方剂粗提取物分成极性不同的组分，以激活巨噬细胞中亚硝酸盐形成的影响为筛选指标，对筛选获得的活性组分进行机制分析，包括炎症中关键酶类诱导型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase，iNOS)、环氧合酶 (cyclooxygenase-2，COX-2)的蛋白表达及总抗氧化能力的测定评价。

1 材料

1.1 药物提取物及组分的制备

1.1.1 药材 均购自上海康桥中药饮片有限公司。

1.1.2 水提取物及其组分制备 防己90 g、黄芪90 g、桂枝90 g、茯苓180 g、甘草60 g，打粉混合，水煎煮，提取3次，滤液浓缩干燥后得浸膏(79.04 g)，分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取3次，得石油醚组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分和萃后水溶性组分。

1.1.3 乙醇提取物及其组分制备 药材和剂量同上，打粉混合，用70%乙醇，80℃，提取3次，滤液浓缩和冷冻干燥后得浸膏 (59.28 g)，分散于水中，石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取3次，得石油醚组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分和萃后水溶性组分。

1.1.4 单味药醇提取物制备 取以上5种单味药各100 g分别打粉，提取 (70%乙醇，80℃)3次，合并滤液和冷冻干燥后得浸膏即为单味药乙醇提取物。

以上提取物及组分用DMSO配成200 mg/mL溶液，－80℃保存，临用前稀释成所需浓度，DMSO终质量分数＜0.1%。

1.2 药物与试剂 RAW264.7细胞购自ATCC公司;RPMI 1640、胎牛血清，购自Gibco公司。二甲基亚砜 (DMSO)、脂多糖 (LPS)、噻唑蓝(MTT)、Griess反应试剂，水溶性维生素 E(Trolox)、TPTZ均购自Sigma公司;蛋白含量测定试剂购自碧云天公司;PVDF膜购自Bio-rad公司;鼠重组干扰素 (IFN-γ)，购自Millpore公司。蛋白梯度对照品，购自Progema公司;iNOS、COX-2、β-actin抗体和二抗购自Cell Signaling Technology公司和Santa Cruz公司。ECL检测试剂购自GE公司。其他试剂均为分析纯。

1.3 实验仪器 Spectra MAX190酶标仪，美国MD公司;超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;单向电泳系统，美国 Bio-rad公司;sMPIC2600C自动X线胶片洗片机，上海申贝公司。

2 方法

2.1 细胞培养 RAW 264.7细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于CO2培养箱中，在37℃和5%CO2条件下培养，隔天传代，取生长对数期细胞进行实验。

2.2 基于细胞炎症模型的体外筛选［6］细胞悬液接种于96孔板，培养过夜。空白对照组采用含0.1%DMSO的RPMI 1640培养细胞，模型组采用脂多糖 (100μg/L)和IFN-γ(1×104U/L)协同刺激细胞，给药组用防己茯苓汤乙醇提取物、水提物、来源于醇或水提物的乙酸乙酯组分、正丁醇组分、萃后水组分、单味药乙醇提取物分别以200、100、50、10μg/mL 4个剂量处理细胞。同时加入诱导剂并培养24 h后，吸取上清培养液100μL，加入100μL的Griess反应液，室温反应10 min，于540 nm处读取光吸收值。计算给药组对细胞上清液中亚硝酸盐积累的抑制率。抑制率 (%)=(模型组吸光值－给药组各剂量吸光值)/(模型组吸光值－空白对照组吸光值)×100%。

2.3 考察乙醇－乙酸乙酯提取组分干预前后对激活和静息巨噬细胞上清液中亚硝酸盐产量的变化［7］细胞分组同前，其中给药组为乙醇－乙酸乙酯提取组分20、40、60μg/mL 3个剂量处理激活和静息细胞。加刺激剂或不加刺激剂维持24 h培养后，Griess法测定各组吸光值并计算乙醇－乙酸乙酯提取组分各剂量对激活或静息态细胞上清液中亚硝酸盐产量的影响。

2.4 考察乙醇－乙酸乙酯提取组分和单味药乙醇提取物对激活或静息态细胞增殖能力的影响［8］激活态细胞的诱导处理和分组同上，静息细胞设空白对照组、乙醇－乙酸乙酯提取组分3个剂量处理组、单味药乙醇提取物4个剂量处理组，吸取上清液100μL后，加入MTT溶液 (PBS溶解，5 mg/mL)20μL，继续培养4 h后，弃上清，加入DMSO150μL，于490 nm读取吸光值，以空白对照组的细胞活力为100%对照，计算乙醇－乙酸乙酯提取组分各剂量对激活和静息细胞增殖能力以及单味药醇提取物对静息巨噬细胞活力的影响。

2.5 三价铁还原抗氧化能力FRAP法［9］测定乙醇－乙酸乙酯提取组分的总抗氧化能力 空白对照组为等量的PBS溶液，标准对照组为1 mol/L Trolox，EAFD处理组为100、200、400μg/mL 3个剂量，245μL新鲜配制的FRAP溶液［0.3mol/L醋酸盐缓冲液∶10mmol/L TPTZ∶20mmol/L FeCl3以10∶1∶1(V/V)混合］，加入5μL各组样品，静置10 min后，593 nm测定对还原Fe3+的能力。以PBS值读数为本底值，各组抗氧化值用各组吸光值以本底值调零后，与1 mol/L Trolox的吸光值比值来表示。

2.6 Western blot检测乙醇－乙酸乙酯提取组分对iNOS和COX-2蛋白表达 细胞接种于30 mm细胞培养皿，培养过夜。分组同上，乙醇－乙酸乙酯提取组分采用20、40、60μg/mL 3个剂量预处理1 h后，加入刺激剂，共同孵育6 h后，收集蛋白上清液进行蛋白量测定。每孔加入50μg的蛋白上样，在7.5%和10%的SDS-PAGE凝胶中电泳，蛋白转移到PVDF膜上，10%脱脂牛奶封闭，分别用一抗iNOS(1 ∶1 000)、COX-2(1 ∶1 000)、β-actin(1∶800)与膜4℃孵育过夜，PBST溶液洗膜3×15 min，IgG-HRP二抗 (1∶2 000～1∶5 000)与膜孵育1 h，PBST溶液洗膜3×15 min，膜控干后加ECL试剂，进行显影、定影。

3 结果

3.1 防己茯苓汤醇水提取物及其组分、单味药乙醇提取物对激活巨噬细胞上清液亚硝酸盐量的影响

方剂中的单味药除黄芪外其它药味均能抑制激活巨噬细胞中亚硝酸盐含量，以IC50从低到高排序为:防己 (30.18μg/mL) ＜甘草(41.92μg/mL)＜茯苓 (54.01μg/mL) ＜桂枝 (71.72μg/mL)。具有抑制的活性组分有水提乙酸乙酯组分，乙醇－石油醚组分，乙醇－乙酸乙酯组分，IC50分别为61.80、44.22、21.00μg/mL，以乙醇 －乙酸乙酯提取组分抑制效果最强，其IC50最低，强于各单味药乙醇提取物对亚硝酸盐的抑制效果 (表1)。

表1 防己茯苓汤提取物及其组分、单味药醇提取物对激活巨噬细胞上清液亚硝酸盐的影响( ± s，n=6)Tab.1 Nitrite accumulation of sam ples on stimulated macrophages( ± s，n=6)

表1 防己茯苓汤提取物及其组分、单味药醇提取物对激活巨噬细胞上清液亚硝酸盐的影响( ± s，n=6)Tab.1 Nitrite accumulation of sam ples on stimulated macrophages( ± s，n=6)

分组 剂量/(μg·mL－1)亚硝酸盐/(μmol·L－1) 抑制率/% 得率/% 分组 剂量/(μg·mL－1)亚硝酸盐/(μmol·L－1) 抑制率/% 得率/%对照组 8.69±0.07 －模型组 76.83±0.02 －水提取物 200 80.67±0.01 0 15.50 100 78.93±0.02 0 50 80.37±0.02 0 10 77.67±0.02 0水-石油醚组分 200 68.95±0.02 11.57 0.06 100 75.86±0.02 1.43 50 77.20±0.03 0 10 80.04±0.05 0水-乙酸乙酯组分 200 11.23±0.01 96.27 1.82 100 10.09±0.00 97.96 50 36.23±0.01 59.59 10 78.07±0.01 0水-正丁醇组分 200 69.06±0.02 11.41 0.92 100 74.34±0.01 3.66 50 74.42±0.01 3.54 10 77.90±0.01 0水-萃后水组分 200 77.47±0.01 0 6.17 100 81.23±0.02 0 50 73.92±0.02 4.28 10 72.51±0.02 6.35乙醇提取物 200 63.85±0.02 19.06 11.62 100 69.49±0.01 10.78 50 62.71±0.02 20.72 10 73.07±0.01 5.53乙醇-石油醚组分 200 14.24±0.00 91.86 0.57 100 11.52±0.00 95.85 50 39.98±0.02 54.09 10 74.98±0.01 2.72乙醇-乙酸乙酯组分 200 11.94±0.01 95.24 3.17 100 11.00±0.01 96.61 50 11.74±0.00 95.53 10 69.75±0.01 10.39醇-正丁醇组分 200 58.39±0.01 27.07 4.99 100 68.67±0.01 11.97 50 71.79±0.02 7.40 10 72.88±0.01 5.81醇-萃后水相组分 200 75.29±0.00 2.26 19.23 100 75.48±0.02 1.98 50 73.78±0.03 4.48 10 74.00±0.02 4.16防己 200 4.55±0.02 97.25 11.03 100 4.28±0.01 98.11 50 24.86±0.04 33.65 10 31.08±0.04 14.17茯苓 200 9.44±0.01 88.02 2.21 100 26.69±0.04 56.75 50 42.99±0.05 27.20 10 44.49±0.08 24.48黄芪 200 57.01±0.02 16.40 47.06 100 58.52±0.01 13.96 50 60.54±0.02 10.71 10 62.68±0.01 7.24桂枝 200 14.18±0.01 72.04 9.32 100 26.02±0.02 38.43 50 24.10±0.04 43.87 10 27.34±0.03 34.68甘草 200 6.07±0.01 98.51 36.62 100 25.86±0.01 66.62 50 40.76±0.01 42.59 10 61.42±0.02 9.29

3.2 防己茯苓汤单味药乙醇提取物对静息巨噬细胞增殖能力的影响 防己和茯苓乙醇提取物在高剂量对静息巨噬细胞具有一定的细胞毒性，黄芪乙醇提取物各剂量对巨噬细胞的增殖无影响，桂枝、甘草乙醇提取物在其抗炎IC50剂量50、100μg/mL对巨噬细胞活力无影响 (表2)。

表2 防己茯苓汤单味药乙醇提取物对静息巨噬细胞增殖能力的影响( ± s，n=6)Tab.2 Effects of cell proliferation of ethanol extract of single herb on resting macrophages(n=6)

表2 防己茯苓汤单味药乙醇提取物对静息巨噬细胞增殖能力的影响( ± s，n=6)Tab.2 Effects of cell proliferation of ethanol extract of single herb on resting macrophages(n=6)

分组 剂量/(μg·mL－1)静息巨噬细胞的细胞活力/%对照组 －100.00±0.10模型组 － －防己乙醇提取物 200 9.45±0.01 100 7.63±0.01 50 56.76±0.01 10 102.97±0.01茯苓乙醇提取物 200 9.30±0.01 100 49.13±0.03 50 51.84±0.04 10 101.66±0.03黄芪乙醇提取物 200 100.98±0.01 100 93.30±0.01 50 97.87±0.01 10 99.77±0.01桂枝乙醇提取物 200 85.32±0.01 100 107.18±0.01 50 105.46±0.01 10 98.30±0.01甘草乙醇提取物 200 43.92±0.01 100 110.30±0.01 50 121.60±0.01 10 107.66±0.01

3.3 防己茯苓汤乙醇－乙酸乙脂提取组分对激活和静息态巨噬细胞中亚硝酸盐和增殖能力的影响防己茯苓汤乙醇－乙酸乙脂组分呈剂量依赖性抑制激活细胞上清液中亚硝酸盐量，对静息巨噬细胞中亚硝酸盐的量无影响;能提升炎症损伤后的细胞活力，对静息巨噬细胞具有促增殖作用 (表3)。

表3 防己茯苓汤乙醇－乙酸乙脂组分 (EAFD)对激活和静息的巨噬细胞的影响( ± s，n=6)Tab.3 Effects of nitrite accumulation and cell proliferation of EAFD on stimulated and restingmacrophages( ± s，n=6)

表3 防己茯苓汤乙醇－乙酸乙脂组分 (EAFD)对激活和静息的巨噬细胞的影响( ± s，n=6)Tab.3 Effects of nitrite accumulation and cell proliferation of EAFD on stimulated and restingmacrophages( ± s，n=6)

组 别 剂量/(μg·mL－1)激活细胞 静息细胞亚硝酸盐/(μmol·L－1) 抑制率/% 细胞活力/% 亚硝酸盐/(μmol·L－1) 细胞活力/%对照组 － 4.28±0.01 － 100.00±0.10 4.28±0.01 100.00±0.10模型组 － 45.78±0.02 － 54.06±0.03 － －乙醇-乙酸乙脂组分处理组 60 14.50±0.01 75.37 77.84±0.05 4.72±0.01 112.28±0.07 40 22.75±0.02 55.49 77.44±0.05 4.46±0.01 110.76±0.05 20 39.99±0.03 13.96 55.39±0.04 4.54±0.01 137.25±0.11

3.4 防己茯苓汤乙醇－乙酸乙脂提取组分的总抗氧化能力测定 如表4所示，乙醇－乙酸乙脂提取组分呈剂量依赖性提升总抗氧化能力。

3.5 防己茯苓汤乙醇－乙酸乙脂提取组分对iNOS和COX-2蛋白表达的影响 如图1所示，乙醇－乙酸乙脂提取组分呈剂量依赖性抑制iNOS蛋白表达 (P＜0.01)，对 COX-2表达仅在最高剂量60μg/mL有显著抑制效果 (P＜0.05)。

4 讨论

传统医学认为水肿等症，乃肺脾肾三脏相干之病，盖水为至阴，故其本在肾;水化于气，故其标在肺;水惟畏土，故其制在脾。防己茯苓汤主治因脾气虚弱而不能运化水湿所致之证，是治疗脾虚水肿证的基础方［10］。 《水气病脉证并治第十四》中记载:“皮水为并，四肢肿，水气在皮肤中，四肢聂聂动者，防己茯苓汤主之。”现代研究发现防己茯苓汤在临床炎症性疾病中也颇有疗效，并在多种炎症动物实验上得以验证。而近年大量的数据证实炎症不仅仅是宿主对外来各种刺激物 (细菌、病毒、紫外线等)的防御反应，肿瘤相关性炎症已作为肿瘤的第7特征［11-12］。在慢性炎症中，炎癌共用信号转导通路如NF-κB和JAK2/STAT3被持续激活，诱使炎症介质如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)的表达提高，同时在细胞因子、趋化因子的共同参与下，协同推动病程向恶性演化［13-14］。

防己茯苓汤中单味药除黄芪外均能抑制巨噬细胞炎症模型中NO过量产生。方中防己、茯苓为君药，取利水消肿、祛风止痛之功，使皮水从外而解。这和防己、茯苓乙醇提取物体外具有较强抗炎活性 (IC50分别为30.18μg/mL和54.01μg/mL)有一定联系，但在其抗炎剂量对巨噬细胞具有杀伤作用。黄芪为臣药，能益气固表和振奋卫阳，其在细胞炎症模型中并未显示具抗炎活性而对巨噬细胞具有一定促增殖作用，提示黄芪可能重在调节免疫，减少君药的毒副作用。桂枝通阳达表，协助茯苓和黄芪发挥着行散水湿和鼓舞卫阳的作用，也显示一定的抗炎活性 (IC50为71.72μg/mL)。甘草益气和中，用为佐使，协黄芪以健脾，体外具抗炎活性 (IC50为41.92μg/mL)且在该剂量对巨噬细胞增殖无影响，可能兼具抗炎和减毒的作用。单味药单独提取的乙醇提取物对体外细胞炎症模型的抗炎活性不及方剂整体提取后乙醇－乙酸乙酯提取组分，且抑制静息态巨噬细胞的细胞活力如单用防己乙醇提取物，提示精制后的活性组分，具有一定的增效减毒的作用。传统水煎获得的提取物在抗炎方面的活性不及乙醇提取物，可能中药抗炎类活性成分以脂溶性小分子居多，水煎制剂可能通过体内代谢才能发挥较强功效。前期一系列实验结果也显示南刘寄奴、祖师麻、桑枝、芫花等中药其抗炎活性集中在乙醇提后的乙酸乙酯组分，主要是黄酮类成分［6，8-9，15］。在本研究中，乙醇 － 乙酸乙脂提取组分抑制炎症关键合成酶iNOS和COX-2蛋白表达，同时提高总抗氧化能力，可作为防己茯苓汤抗炎药效的物质基础。

表4 防己茯苓汤乙醇-乙酸乙脂组分 (EAFD)的总抗氧化能力测定( ± s，n=3)Tab.4 Antioxidants activities of EAFD(mmol/L Trolox equivalent， ± s，n=3)

表4 防己茯苓汤乙醇-乙酸乙脂组分 (EAFD)的总抗氧化能力测定( ± s，n=3)Tab.4 Antioxidants activities of EAFD(mmol/L Trolox equivalent， ± s，n=3)

注:与对照组相比，＊＊P ＜0.01。

级 别 剂量/(μg·mL－1) 抗氧化当量 (1mmoL/L Trolox当量)对照组(PBS) － 0.09±0.00乙醇-乙酸乙脂组分处理组400 0.37 ±0.01＊＊200 0.18±0.01 100 0.13±0.00阳性对照组(Trolox) 1 mmol·L－11

图1 防己茯苓汤乙醇-乙酸乙脂组分 (EAFD)对iNOS和COX-2蛋白表达的影响Fig.1 Effects of EAFD on protein exprssion of iNOS and COX-2

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