氟西汀在实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠急性期的作用研究

王倩倩，张美妮

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是中枢神经系统（central nervous system，CNS）慢性自身免疫性炎症性疾病，主要的病理特点为髓鞘脱失、炎性细胞浸润和轴索损害。Tau蛋白属于微管相关蛋白，主要存在于轴索上，在体外一般认为是促进微管装配的因素[1]。Tau蛋白的生理学作用是稳定微管和维持神经元形状和极性[2]。氟西汀是选择性－5羟色胺（5－HT）再摄取抑制剂，广泛应用于抑郁症治疗，有研究表明氟西汀具有免疫调节作用[3]。本研究拟建立实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）小鼠模型，探讨氟西汀对EAE小鼠急性期的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验分组 将18g～20g，8周～10周，C57BL／6雌性小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）60只随机分为氟西汀组、EAE组和对照组，每组各20只。

1.2 EAE模型制备 0.01mol／L的PBS将 MOG35－55（武汉博士德公司）稀释，然后将稀释液与等量含结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂（武汉博士德公司）混合，用玻璃注射器抽吸成油包水状，制成诱导EAE的抗原乳剂。氟西汀组和EAE组小鼠背部中央偏头侧皮下注射抗原乳剂。利用生理盐水代替MOG35－55稀释液，参照上述方法制备乳剂，供对照组使用。各组于免疫后第0天、第2天分别腹腔注射百日咳毒素（美国Sigma公司），每只600ng作为免疫增强剂。

1.3 给药方法 氟西汀组于免疫前14d到免疫前1d每日胃管灌入氟西汀（百忧解，生产由Patheon France，分包装由礼来苏州制药有限公司）10mg／kg，EAE组和对照组于免疫前14d到免疫前1d每日胃管给予等量生理盐水。

1.4 观察实验指标 从免疫当日起，采用双人双盲的方式隔天观察和评定小鼠临床症状的严重程度及体重变化（评分标准采用国际通用的5分制评分法）。免疫25d后，10%水合氯醛按0.1mL／20mg腹腔注射麻醉后，小鼠左心取血，左心室灌注磷酸盐缓冲液至肝脏变白，再使用4%多聚甲醛至尾部僵直，解剖取大脑。用ELISA方法检测血清Tau蛋白。用HE染色观察炎症及轴索损害情况。

2 结 果

2.1 小鼠临床症状评分 EAE组小鼠于免疫10d后开始陆续发病，免疫后13d～20d达到发病高峰期，发病率为80%。发病时表现为皮毛不光滑、食欲下降、体重减轻、活动量减少；同时相继出现中枢神经系统受损症状，先是表现为尾部肌张力低下，身体向一侧倾倒，进一步进展为双侧后肢无力，不能翻身或翻身力弱，靠前肢爬行，无因病情危重而死亡。20只中4只未发病。免疫25d后取样，除未发病4只的所有小鼠。氟西汀组小鼠于免疫13d后开始陆续发病，免疫后13d～20d达到发病高峰期，发病率为80%。症状与EAE组相比较轻，20只中有4只未发病，与EAE组相比，氟西汀组在神经功能评分有统计学差异。对照组小鼠一直没出现神经系统症状，体重持续上升，与EAE组相比，神经功能评分差异有统计学意义。详见表1。

表1 各组神经功能评分比较（±s） 分

表1 各组神经功能评分比较（±s） 分

组别 n 神经功能评分EAE组 16 2.533±0.698氟西汀组 16 1.270±0.3761）对照组 20 01）与EAE组相比，1）P＜0.01

2.2 血清中Tau蛋白表达（见表2）

表2 各组Tau蛋白比较（±s） pg／mL

表2 各组Tau蛋白比较（±s） pg／mL

组别 n Tau蛋白EAE组 16 80.710±4.217氟西汀组 16 58.260±5.3661）对照组 20 19.950±2.8032）与EAE组相比，1）P＜0.01，2）P＜0.001

2.3 组织病理变化 HE染色发现EAE组小鼠大脑炎性浸润呈典型的“袖套样”改变，浸润细胞以淋巴细胞和中性粒细胞为主，并且炎性浸润部位及程度与临床症状密切相关。氟西汀组小鼠大脑实质中炎性细胞浸润明显减少。对照组小鼠大脑未见明显异常改变。

3 讨 论

本研究表明氟西汀能促进急性期EAE小鼠神经功能缓解。Mostert等[4]的研究表明MS患者使用氟西汀之后，使 MRI增强病灶数目减少。本研究中，组织学表明EAE组小鼠大脑炎性细胞浸润增多，氟西汀组小鼠大脑炎性细胞浸润较EAE组减少。氟西汀的抗炎作用并未完全明确，但是研究表明氟西汀可能通过5－HT的调节来发挥作用。O’Connell等[5]认为氟西汀抑制树突细胞从细胞外环境摄取5－HT和活化T细胞（合成5－HT）。可能导致减少环磷酸腺苷（cAMP）的产生和促进初始T细胞的活化和分化[6]，这可能是治疗 MS的一个机制。氟西汀提高星形胶质细胞内cAMP信号传导，下调了Ⅱ类反式激活蛋白，从而抑制了促炎因子MCH－Ⅱ[6，7]。这个机制可以抑制具有免疫活性的CNS抗原提呈细胞所介导的免疫反应。病灶内轴索损伤与病灶内炎症程度相关，表明炎症是轴索损伤和脱髓鞘的病因。干扰素－γ（INF－γ）是导致髓鞘损伤和修复免疫介导的脱髓鞘病变的主要促炎性细胞因子[8]。MS患者和EAE小鼠的CNS中发现有高浓度的INF－γ蛋白和mRNA，并且和疾病的严重程度相关[9]。使用抗IFN－γ抗体治疗EAE小鼠能减少EAE的发病率。氟西汀能减少促炎性因子INF－γ、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）的释放，增加抗炎因子白介素－10（IL－10）的释放[10]。氟西汀通过减少INF－γ，抑制炎症反应，减轻轴索损伤、脱髓鞘以及减少病灶。因此IFN－γ表达的调节可能是氟西汀治疗EAE的机制之一。氟西汀作为MS的候选药的原因还包括：星形胶质细胞的神经营养因子的产生，比如脑源性神经营养因子，刺激星形胶质细胞糖原分解和钠离子通道的阻碍[11－13]。钠离子通道活化和星形胶质细胞内糖原分解受损导致减少轴索能量代谢被认为在MS患者轴损害中起了很重要的作用[14]。MS患者中，氟西汀提高脑白质N－乙酰门冬氨酸／肌酸的比例，而N－乙酰门冬氨酸／肌酸被认为是轴索能量代谢的一种指标。Tau蛋白被认为是轴索损害、疾病进展和不可逆神经功能缺损的生物学标记。本实验研究表明氟西汀干预组和对照组相比，血液中Tau蛋白浓度显著减少，神经功能评分差异显著，认为氟西汀促进EAE小鼠神经功能的缓解。

总之，氟西汀能促进急性EAE神经功能缓解和抑制CNS脱髓鞘，表明其有神经保护作用。

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