鳗鲡病原性气单胞菌外膜蛋白基因全长的克隆与抗原决定簇分析

郭松林 王玉 关瑞章 冯建军 林鹏 杨求华

鳗鲡疾病按病原可分为细菌性、真菌性、寄生虫性、病毒性及其他类型病原五大类，其中细菌性疾病危害十分严重，其导致的经济损失占疾病总损失的90％以上。已发现的欧洲鳗鲡细菌性病原有十几种，包括气单胞菌属的嗜水气单胞菌（A.hydrophila）、威隆气单胞菌（也称维氏气单胞菌，A.veronii）、温和气单胞菌（A.sobria）、豚鼠气单胞菌（A.caviae）和兽生气单胞菌（A.bestiarum），爱德华氏菌属的迟顿爱德华氏菌以及弧菌属的致伤弧菌、鳗弧菌和非01群霍乱弧菌［1-4］。在我们课题组近10年建立的87株鳗鲡病原菌菌种库中，有约80％为病原性气单胞菌。由于气单胞菌血清型复杂［5］，且具有地缘性与种间特异性［6］，故研制的灭活疫苗难以在养殖生产中应用［7］。解决此问题的途经之一是寻找病原菌间的共同保护性抗原基因片段，以制备预防同种或同属但血清型不同病原菌所致疾病的基因工程疫苗［8］。革兰氏阴性病原菌表面的外膜蛋白（Outermembrane proteins，OMP）是革兰氏阴性菌细胞壁的特有成分，除了在维持菌体外膜结构及物质转运方面发挥重要作用外，还是一种重要的保护性抗原，能有效激发宿主的体液免疫和细胞免疫，在宿主体内具有良好的免疫原性［9］。同时，某些OMP在多种病原菌间存在高度保守性，可对同属不同种或同种不同血清型菌株的感染产生交叉保护，从而成为亚单位疫苗最具潜力的抗原候选成分之一［10-12］。

本研究拟采用已分离到的30株鳗鲡病原性气单胞菌为材料，使用NCBI/GenBank 数据库检索获得多个气单胞菌的外膜蛋白基因序列，经比对分析后，从嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞胞菌（A.salmonicida）全基因组中钓出特定外膜蛋白的基因全长及该基因以外两端的序列，据这两端序列在嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞胞菌中的保守性设计特异性引物，PCR扩增30株病原性气单胞菌的外膜蛋白基因并对其推导的表达产物进行结构和功能分析，从而为鳗鲡外膜蛋白共同保护性抗原基因工程疫苗的研制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验仪器主要包括高速冷冻离心机（Sigma），台式离心机H1650-W（湖南湘仪），PCR仪（东胜创新），琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一），生化培养箱（SHP-250）和微波炉（DJ21F-B）等。主要试剂为 Taq 酶（5U/μL），dNTP（2.5mmol/L），10×loading buffer，引物和DNA Marker购自上海捷瑞生物工程有限公司，溴化乙锭（EB）购自百维信公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自BioTeke公司。

30株鳗鲡病原性气单胞菌由鳗鲡工程研究中心病原菌菌种库提供，经Biolog自动菌鉴系统（含96个生化指标）分别鉴定到种或属。其中嗜水气单胞菌9株；威隆气单胞菌16株；豚鼠气单胞菌3株；简达气单胞菌1株；另1株仅鉴定为气单胞菌属（表 1）。

表1 30株病原性气单胞菌的鉴定结果

1.2 方法

1.2.1 细菌培养与DNA模板的制备 30株病原菌接种于胰蛋白胨大豆培养基（TSB），28℃培养24h。采用BioTeke公司的试剂盒（离心柱型）提取，提取方法参考试剂盒内的说明书。提取的DNA经1 ％琼脂糖凝胶电泳检测后，紫外分光光度计测DNA含量，调DNA含量为50ng/μL，备用。

1.2.2 病原性气单胞菌外膜蛋白基因序列的检索、筛选与比对 利用核酸序列数据库NCBI/GenBank，以关键词 “outerme-mbrane protein” ＆“Aeromonas”进行检索。下载包括基因登录号，基因序列，病原菌来源等外膜蛋白序列的主要信息，建立气单胞菌外膜蛋白（Aeromonas ＆ outermembrane protein）基因资料库。选取资料库中17株700bp以上的外膜蛋白基因序列（GenBank序列登录号：HQ331525.1，HM-114316.1，GU134620.1，AF146597.2，FJ437031.1，FJ-437030.1，GU196148.1，DQ008470.1，AY442271.1，AY378290.1，AF276639.2，FJ208990.1，EU309491.1，DQ177328.1，AB290200.1，FJ711769.1，AF183931.1），经Clustal X1.83比对分析后，采用Mega4.0软件构建17条序列的系统发育树。

1.2.3 引物设计与PCR扩增 参考17条序列的基因比对结果，采用其中4条外膜蛋白（Ⅱ型孔蛋白）基因序列（AF183931.1，AF276639.2，FJ437031.1，FJ437030.1）的高度保守区域（ccgaccgatatcttcaacgagtg），从嗜水气单胞菌（登录号：CP000462）和杀鲑气单胞菌（登录号：CP000644）基因组全长序列中钓出该蛋白的基因全长及该基因外上游与下游的两端序列。根据两端序列在嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的保守性，采用Premier 5.0软件设计引物，以扩增30株病原性气单胞菌的Ⅱ型孔蛋白（约1250bp）。上游引物F：5' CTTCGCTGACACAGGGAATAAC 3'，下游引物 R：5' AGACAACGTGAACTGGCG 3'。PCR 扩增反应体系（50μL）：10×PCR Buffer 5μL，dNTP（10mmol/L）0.5μL，引物（10μmol/L）各 0.2μL，Taq 酶（5U/μL）0.4μL，DNA 模 板 2μL， 补无菌水至50μL。反应条件：94℃变性5min，94℃1min，51℃ 1min，72℃ 2min，33 个循环，72℃延伸 l0min，4℃ 保存。

1.2.4 扩增基因的测序与比对分析 PCR反应产物进行1％ 琼脂糖凝胶电泳，观察并拍照记录扩增效果。将扩增产物割胶回收后送至Invitrogen公司直接测序，然后用ClustalX1.83比对分析后，采用Mega4.0软件构建测序结果的系统发育树。

1.2.5 氨基酸序列的比对分析 将扩增到的10株气单胞菌基因和网上已经递交的2个Ⅱ型孔蛋白全长序列翻译为氨基酸序列后，用ClustalX1.83进行多重比对并列表分析Ⅱ型孔蛋白氨基酸序列的相似性。1.2.6 推导Ⅱ型孔蛋白的结构、亲水性与抗原决空簇分析 据扩增得到的10株气单胞菌的外膜蛋白全长序列，选取其中一株菌（B11）的Ⅱ型孔蛋白DNA全长序列，转换为氨基酸序列后，用SOPMA程序（http：//www.expasy.ch/tools/）和 SOSUI 法［14］（http：//bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html）分别对推导蛋白进行二级和三级结构预测；以DNAstar软件的Editseq和Protean程序分别对该蛋白质分别进行亲水性与免疫原性分析［13］，通过BioEdit和Clustalx软件分别对10个气单胞菌Ⅱ型孔蛋白DNA全长序列进行抗原决定簇及其保守性比对分析。

2 结果

2.1 气单胞菌外膜蛋白参考序列的系统发育

从17条气单胞菌外膜蛋白基因序列的系统发育分析结果可知，在黑箭头处遗传距离标尺约0.13时，这些序列可分为8个分支，第一个分支有6条序列，其中2条为主要外膜蛋白（DQ008470.1，FJ20899-0.1），3条为推测外膜蛋白（AY442271.1，AF1465-97.2，EU309491.1），1条为外膜蛋白A前体（GU-196148.1）；第2个分支为2条I型外膜蛋白序列（AB290200.1、FJ711769.1）；第 3个分支为 4条Ⅱ型孔蛋白序列（AF183931.1，AF276639.2，FJ4370-31.1，FJ437030.1）。其余5条序列各为1个分支，分别为主要外膜蛋白（DQ008470.1），外膜蛋白前体N（AY378290.1），外膜蛋白（GU134620.1），外膜蛋白W（HM114316.1）和类似外膜蛋白（HQ331525.1）（图1）。由于前3个分支只有4个Ⅱ型孔蛋白序列有一个高度保守的片段（ccgaccgatatcttcaacgagtg），故使用这个外膜蛋白进行鳗鲡病原性气单胞菌的外膜蛋白扩增。

图1 17个气单胞菌已知外膜蛋白基因片段的系统发育树

2.2 鳗鲡病原性气单胞菌外膜蛋白基因全长的PCR扩增

通过PCR扩增30株病原性气单胞菌的Ⅱ型孔蛋白基因，经琼脂糖电泳结果（图2）显示，有11株 菌（B11、B14、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B60-1、B65）都得到了较单一的PCR扩增产物，扩增出的基因分子量在1200bp左右，与预期目的条带大小一致，除一株菌（B60-1）外，其余10株菌均测出Ⅱ型孔蛋白的全长序列。

图2 30株气单胞菌外膜蛋白基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 鳗鲡病原性气单胞菌外膜蛋白基因的系统发育分析

10 个（B11、B14、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B65）Ⅱ型孔蛋白基因全长序列的开放阅读框在1038bp到1 125bp之间。这10个菌株包括2株威隆气单胞菌（B53、B53-1）和1株豚鼠气单胞菌（B14），其余7株为嗜水气单胞菌（表1）。将10条序列与1条已知Ⅱ型孔蛋白（AF-183931.1）和2条分别从嗜水气单胞菌（登录号：CP000462）和杀鲑气单胞菌（登录号：CP000644）基因组全长钓出的Ⅱ型孔蛋白序列（seqAh-omp II和seqAs-omp II）进行同源性分析，结果（图3）表明，除1株豚鼠气单胞菌（B14）外，其余12个Ⅱ型孔蛋白基因均具有较高的同源性。Mega4.0构建的系统发育树表明，该基因在菌株间的遗传距离在0.000-0.358之间，平均为0.179，其中菌株B11与其余菌株在该序列的平均遗传距离为0.187，接近平均遗传距离。因此，本研究以该序列的理论表达产物为代表进行蛋白质结构与抗原决定簇分析，从而为该基因的进一步表达和表达产物的免疫原性及交叉保护研究奠定理论基础。

图3 13个病原性气单胞菌Ⅱ型孔蛋白基因全长的系统发育树

2.4 B11菌株Ⅱ型孔蛋白基因表达产物的结构与功能

2.4.1 二级与三级结构分析 采用SOPMA 程序对B11菌株OMPⅡ的表达产物进行氨基酸分析。结果表明，该基因共编码 362个氨基酸，其中有78个碱性氨基酸（28个赖氨酸K，9个精氨酸R，41个组氨酸H）和52个酸性氨基酸（36个天冬氨酸D，16个谷氨酸E）；132个非极性疏水氨基酸（39个丙氨酸A，14个异亮氨酸I，24个亮氨酸L，23个苯丙氨酸F，7个色氨酸W，25个缬氨酸V）和163个极性中性氨基酸（23个天冬酰胺N，1个半胱氨酸C，14个谷氨酰胺Q，26个丝氨酸，27个苏氨酸T，26个酪氨酸Y，42个甘氨酸G，4个蛋氨酸M）；3个脯氨酸P，1个任意氨基酸X。利用SOPMA 程序预测的蛋白质二级结构分析结果（图4）显示，此外膜蛋白可形成螺旋（Helix）、片层（Sheet）、转角（Turn）和卷曲（Coil）等结构；其中α螺旋（Alphahelix Ah）比例约27.81％；未形成β螺旋和γ螺旋；舒展性螺旋（Extended strand Ee）比例约25.00％；β转角（Beta turn Tt）比例约3.57％；无规则卷曲（Random coil Cc）比例约43.62％；其他结构域为0 。

图4 SOPMA法预测Ⅱ型孔蛋白基因编码的蛋白质二级结构

SOSUI 法预测结果（图5）显示，外膜蛋白氨基酸序列存在信号肽区和跨膜螺旋区，其中前者由4个氨基酸组成，后者由23个氨基酸组成，其余335个氨基酸均为该外膜蛋白细胞膜外的氨基酸序列，这些膜外序列常认为是可刺激宿主产生免疫反应的保护性抗原。

图5 SOSUI 法预测Ⅱ型孔蛋白基因编码的蛋白质三级结构

2.4.2 亲水性分析 DNAstar软件Protean TM程序的Plot-Kyte-Doolittle 法预测结果（图6）显示，此外膜蛋白有大约90％以上的区域处于正高分值（纵坐标正值越大，亲水性越强），表明该蛋白具有良好的亲水性，属亲水性蛋白，此结果为该基因所表达蛋白质的纯化提供了有价值的参考。

图6 Ⅱ型孔蛋白基因表达产物的的亲水性分析

2.4.3 抗原决定簇分析 采用DNASTAR软件Lasergene程序ProteanTM模块中的Jomeson-Wolf 法预测分析Ⅱ型孔蛋白的免疫原性，结果（图7）表明此外膜蛋白大约85％抗原峰值大于临界值0，处于正分处（纵坐标正值越大，免疫原性越强）。根据主要的抗原峰推测该蛋白有15个抗原决定簇，其在蛋白质上的氨基酸顺序分别位于24-32、43-53、84-92、94-101、103-112、120-127、157-163、181-187、194-201、237-248、266-274、275-285、307-312、314-322和346-355，指示该蛋白理论上具有良好的免疫原性。

图7 Ⅱ型孔蛋白基因表达产物的免疫原性分析

2.5 Ⅱ型孔蛋白基因推导氨基酸序列的比对与共同抗原决定簇分析

通 过 BioEdit和 Clustal X软 件 对 9个（B11、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B65）Ⅱ型孔蛋白基因和3个参考基因（AF183931.1，seqAh-omp II和seqAs-omp II）的氨基酸序列进行比对分析发现，12个孔蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性。将这些同源序列与B11菌株的抗原决定簇分析结果进行比较，结果发现6个存在于12株菌中的保守抗原决定簇（图8，下划线部分）。这6个抗原决定簇在B11中的氨基酸序列分别为第24-32（YDKDGTTFD），120-127（DGSQYGKI），157-163：（DGRQEGQ），181-187（TNDDQAV），275-285（GYKDKGRGYEL）和 346-355（MDNKDDEWTV）。6个保守抗原决定簇仍然存在少许的差异：第一个决定簇的第7个氨基酸在B53和B53-1中为S，而在其它菌株中为T；第2个决定簇的第2个氨基酸在seqAs-ompII和B11中为S，而在其它菌株中为T，第7个氨基酸在AF183931.1中为V，其他菌株中为I；第3个决定簇的第2个氨基酸在seqAs-ompII中为S，其它菌株中为G；第4个决定簇的第4个氨基酸在B48和B65中为N，其它菌株中为D，但在第5个氨基酸处区别稍大，4个K，3个Q，E和V各两个，1个T，第7个氨基酸在seqAs-ompII中为E，其它菌株中为V；第5个决定簇的第2个氨基酸区别稍大，有5个Y，4个D，2个N和1个R，第4个氨基酸在B48和B65中为G，其它菌株中为D；第6个决定簇的第3个氨基酸在seqAs-ompII、AF183931.1和B20中为D，其它菌株中为E；第4个氨基酸在B20、AF183931.1、B53和B53-1中为F，而在其他菌株中为W。

3 讨论

近年的大量研究发现，鱼类病原菌的外膜蛋白（OMP）是疫苗研制的重要保护性抗原［12，13］。随着基因组学、蛋白质组学及生物信息学等学科的快速发展，越来越多的病原菌OMP基因测序得以完成。根据互联网数据库已知OMP的基因序列设计特异性引物，然后从鱼类病原菌库的基因组中扩增目标基因，再利用合适的载体进行重组表达，大大加快了疫苗抗原筛选的速度。这些重组OMP保持了天然OMP的免疫原性和免疫保护作用，均能有效刺激鱼体产生特异性抗体［8］，某些OMP还能显著增强机体吞噬细胞的吞噬活性［15］，并能对相应病原菌的攻毒感染提供50％-100％不等的免疫保护率。随着研究的深入，目前已发现某些OMP为不同病原菌或同种病原菌不同血清型的共同保护性抗原，免疫后可对多种病原菌的交叉感染提供免疫保护作用。Kawai等［16］分别从3株不同血清型的迟钝爱德华氏菌中，利用十二烷基肌氨酸钠抽提、超速离心、免疫印迹、双向电泳等方法均分离纯化到分子量大小约为37kD的OMP。该蛋白免疫日本牙鲆后，对3株病原菌的感染分别提供50％、65.5％和70％的交叉免疫保护作用。Fang等获得分子量为43kD 的重组OMP，并利用氨基酸序列同源性分析、Western blot 免疫印迹等方法证明该OMP是9株嗜水气单胞菌和1株温和气单胞菌的共同OMP抗原。该重组OMP免疫蓝丝鲈后，能够针对其中2株相同血清型和1株不同血清型嗜水气单胞菌的感染提供分别为87.5％、75％和44.4 ％的交叉免疫保护率［17］。同时，也可利用融合PCR 技术将多种共同或主要抗原基因进行融合表达，以进一步构建多价重组外膜蛋白疫苗，从而进一步扩大对病原菌的交叉保护范围［18］。

图8 12个Ⅱ型孔蛋白基因推导的氨基酸序列的比对

本研究利用核酸序列数据库NCBI/GenBank，找到气单胞菌属的17外膜蛋白基因序列并进行比对，采用相关软件构建这些序列的系统发育树；并通过一定的遗传距离将其分为8个分支，若分支中含有多个序列，则根据其保守区域从嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌基因组全长序列（登录号分别为CP000462和CP000644）中搜索该基因在基因组中的位置并在该基因之外的上下游约100bp的两端设计引物，以扩增出该基因序列的全长。本试验根据图1的第1、2和4等3个分支分别找到了3个基因在嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌基因组全长序列中的位置，并按上述方法分别设计了3对引物，以30株病原性气单胞菌的DNA为模板进行扩增。结果发现第4个分支的II型孔蛋白基因能扩增到11个目的基因并测出了其中10个基因的全长序列，其余两支仅分别能扩增到4株和0株菌的基因（数据未在本论文提供），表明II型孔蛋白可能是存在于鳗鲡源病原性气单胞菌的主要外膜蛋白［5］。

扩增10株菌的OMP基因序列与3个参考序列比对分析后显示，B11菌株的OMP基因序列与其它菌株的序列平均遗传距离居中，有可能成为这些菌株间的交叉保护抗原。此外，B11菌株毒性较强，其对欧洲鳗鲡的半数致死量约为105CFU/g体重［19］，且具有良好的研究背景［5，20-21］。采用该基因约500bp的序列片段构建重组表达载体，其表达的30kD外膜蛋白经皮下注射免疫欧洲鳗鲡后，对嗜水气单胞菌（B11）和温和气单胞菌的攻素毒感染能分别提供50％和70％的相对保护率［12］。免疫原性分析表明，该表达产物有15个抗原决定簇，其中14个决定簇位于该蛋白的细胞膜外区域，有望在病原性气单胞菌间产生广泛的交叉免疫保护作用［18，22］。因此，本研究采用的免疫原性分析软件对II型孔蛋白基表达产物的理论分析具有较好的预测能力。另外，对12个基因序列推导的氨基酸序列进行比对分析后，发现存在于多株鳗鲡病原性气单胞菌间的6个较为保守的抗原决定簇，提示该基因表达的OMP很可能对多株病原菌的感染产生交叉保护，有待于进一步研究证实。

B11菌株扩增基因推导OMP的二级结构显示，该蛋白有362个氨基酸，能形成的螺旋（Helix）、片层（Sheet）、转角（Turn）和卷曲（Coil）等结构，提示其具有复杂的空间结构；三级结构分析表明该蛋白具有信号肽、跨膜区和膜外区域，而膜外蛋白区域通常直接暴露于鱼类的免疫系统，易被免疫系统识别并产生有效的免疫反应［8，12］。因此，二级与三级结构分析为该蛋白的免疫原性研究奠定了坚实的理论基础［23］。此外，该OMP的亲水性分析表明其亲水性较高，此结果为该表达蛋白的进一步纯化提供了有价值的参考［24］。值得一提的是，本研究材料中的30个菌株包含4种细菌，从1株豚鼠气单胞菌（B14）扩增到的该基因与其他9个基因同源性很低，未从简达气单胞菌（B29）中扩增到该外膜蛋白基因，因此，B11菌株表达的OMP对这两个菌种的免疫交叉保护也有待于研究证实。然而，我们的研究表明，嗜水气单胞菌和威隆气单胞菌为近10年从养殖的发病鳗鲡分离的主要菌株［21，25］，以本研究为基础研制的外膜蛋白共同保护性疫苗将具有良好的应用前景。

4 结论

比对17个气单胞菌己知外膜蛋白基因序列，获得其中一种外膜蛋白（Ⅱ型孔蛋白）基因的保守片段，通过该片段从嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌基因组中钓出该基因全长。据该基因以外两端的序列设计特异性引物，以30株鳗鲡病原性气单胞菌基因组DNA为模板，扩增并获得10株菌的Ⅱ型孔蛋白基因全长。经遗传距离分析后选择一株菌（B11）的Ⅱ型孔蛋白基因，该基因的表达产物具有三级结构，亲水性强且有15个抗原决定簇，其中6个为存在于9株鳗鲡病原菌间的保守抗原决定簇。

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