中国恒河猴肠道菌群特征揭示

赵娜 刘社兰 路纪琪 何宏轩 赵宝华

人类和灵长类动物在形态、生理、基因和行为上的近似使得灵长类成为研究人类疾病的模型，其中恒河猴（Rhesus Macaques）是被研究得最清楚的旧世界猴，被广泛应用于生命科学研究领域。在恒河猴养殖业，尤其是处于食性转换期和特殊生理时期的恒河猴个体中，由于病毒和肠道病原体传染造成的疾病严重威胁恒河猴的健康。传统研究肠道菌群特点的方法主要是选择性培养，但是由于肠道中大多数细菌不能用传统研究方法进行培养、分离和鉴定［1，2］，因此人们对恒河猴肠道及粪样微生物的变化规律知之甚少。

DGGE技术可以快速检测传统条件不能培养的细菌，发现新的微生物，作为微生物分子生态学研究的重要手段，被广泛地应用于微生物群落多样性和动态分析［3］。16S rRNA基因DGGE图谱条带数目可以反映微生物菌群的多样性，条带染色后的亮度可以相应反映细菌在群体中的丰度。对PCR-DGGE分离得到的条带进行克隆测序或杂交可以进一步准确鉴定细菌的种属［4，5］。与普通PCR相比，实时荧光检测技术（Real-time PCR）可以对整个PCR过程中产物的扩增过程加以监测，能够直观地反映PCR模板浓度与扩增产物含量之间的关系，具有高度准确性，目前，这项技术已经被广泛用于动物肠道菌群检测及环境微生态的检测研究［6］。

McKenna等［7］运用焦磷酸测序技术研究了慢病毒感染及慢性结肠炎的恒河猴的肠道微生态特点，并简单与健康恒河猴进行比较，但是迄今为止没有系统关于不同年龄段健康恒河猴个体肠道主要菌群多样性及其特点的报道。本研究采用PCR-DGGE和实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR）技术研究24只处于6个不同年龄组、不同生理状态的恒河猴个体粪样中肠道菌群的变化规律，从定性和定量的角度加以揭示，以期发现由于食性改变及生理状态改变造成的肠道疾病的根源。

1 材料与方法

1.1 粪样的收集及处理

选择饲养在河南省郑州动物园的24只健康恒河猴，婴幼龄（1月龄）、青年（1-4岁）、亚成年（4-5岁）、成年（5-10岁）、老年（10岁以上）、孕期（怀孕后期，孕龄15-18周）各4只，除了孕期组以外的五组中个体均雌雄各半。除婴幼龄个体母乳喂养外，其他组别个体均以胡萝卜、苹果、马铃薯和玉米饼为饲料，每日投喂两次。2011年2月，每个个体取3份样品，每次取样间隔1周。

所有72个粪便样品在采样时均收集在无菌塑料容器内，放置在干冰上，30min内运到实验室。每份粪便样品混合均匀后，分装出3份至灭菌离心管中，200mg每份，然后冻存于-80℃直至分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每个个体冻存的3份不同时间点收集的样品各一份混合均匀，等量分成3份（200mg每份）。参照Yanfei等［8］方法将样品加到提前加好300mg0.1mm玻璃珠（Sigma）的2mL破壁管中，加入1.4mL ASL缓冲液（QIAamp DNA Stool Mini Kit）之前，放于冰上。然后于FastPrep FP120震荡仪上6.5速度震荡45s，随后于97℃水浴锅中5min水浴。随后参照QIAamp DNA Stool Mini Kit 说明书步骤进行。最后，用200μL TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0）洗脱。取 1μL 于NanoDrop ND-1000测所提细菌基因组DNA浓度，其A260/A280在1.6-1.8之间，浓度范围在50-70ng/μL之间。后将DNA样品-80℃超低温冰箱保存备用。

1.2.2 PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）

1.2.2.1 PCR扩增 为避免非特异性PCR产物出现，16S rRNA V3可变区基因PCR扩增采用Muyzer等［3］提出的热启动touchdown方法。由通用引物（F357-GC clamp：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGGCCTACGGAGGCAGCAG-3'，R518：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）扩增。

25μL反应体系包括：1 U TaKaRa Taq热启动聚合酶，10×PCR buffer，上下游引物各10 pmol，20mmol/L dNTPs，20ng DNA模板。94℃预变性3min，94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸 1min，20个循环，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸 1min，5个循环，72℃延伸 5min，4℃ 15min。为消除产物中的异二聚体，采用reconditioning PCR技术，以20ng的PCR产物为模板进行reconditioning PCR［9］。反应程序如下 ：94℃预变性 3min，94℃变性20s，56退火30s，72℃延伸30s，5个循环；72℃延伸7min，4℃ 15min。1％琼脂糖凝胶检测扩增结果，UVI凝胶成像系统照相记录，目的条带200bp，条带明亮单一，保存产物以进行DGGE。

1.2.2.2 DGGE 考虑同张DGGE指纹图谱比较清晰，且样品前期处理已经做到混合，每组选择两个样品进行DGGE电泳，除孕期恒河猴，其余各组均是雌性个体和雄性个体各一。参照Muyzer的方法，对PCR产物进行DGGE电泳分离。电泳前，对PCR产物进行浓缩使所有样品达到浓度一致。使用Bio-Rad 公司的D-code Universal Mutation Detection System进行DGGE电泳。配置37％-78％（100％变性梯度包含40％去离子甲酰胺和7mol/L尿素）变性范围的8％聚丙烯酰胺变性胶，16S rRNA基因 V3 区PCR 产物 15μL+5μL 10×loading buffer 注射针上样，恒温60℃，69 V电压1×TAE缓冲液中电泳16h。

电泳完毕后，使用现稀释的0.1％SYBER Green I溶液避光染色2次，每次30min。染色结束后用去离子水冲洗胶2次，于UVI自动凝胶成像仪中拍照。对DGGE凝胶上感兴趣的条带，进行割胶回收。

1.2.3 PCR产物扩增及克隆测序

1.2.3.1 PCR扩增及产物纯化 DGGE割胶条带放入50μL RNA free H2O的离心管中，4℃浸泡过夜。取2μL浸泡液作为模板，无GC夹子引物F357和R518各10 pmol进行PCR扩增。程序：94℃预变性3min，94℃变性 20s，56℃退火 30s，72℃延伸 30s，25个循环；72℃延伸7min，4℃ 15min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳拍照确定阳性条带后，用天根公司DNA回收试剂盒回收。

1.2.3.2 克隆测序 回收产物连接Promega公司pGEM-T Easy Vector并转化 Escherichia coli DH5α cells。为确保正确插入，阳性克隆子再度用pGEM-T 特异性引物 T7（5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'）和 Sp6（5'-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3'）进行验证。正确插入的克隆子重新重复之前DGGE的步骤进行DGGE电泳，确定电泳条带的正确性。电泳位置与之前一致的条带DNA送北京华大基因测序，每个条带的平板测4个阳性克隆。

1.2.3.3 DNA序列进化树构建 BLAST软件分析序列去除载体序列并对序列加以整理对齐。将整理后的序列信息导入MOTHUR软件，按照97％的相似性标准，将这些序列划分分类操作单元（OTU）。将这些OTU序列与NCBI GenBank的16S rRNA基因序列进行比对，下载相似性较高的序列，BLAST处理后作为背景序列与测序所得序列一起导入MEGA5采用邻接算法进行构建进化树［10］。

1.2.4 DGGE分析 采用Quantity® One 1-D Analysis software对DGGE凝胶图谱进行标化处理，根据图谱中各条带数目、迁移位置和强度进行胶的数字化处理，应用UPGMA算法进行泳道相似性聚类分析，将数据导入MATLAB 2008进行主成分分析（principal component analysis，PCoA）。主成分分析是将一组变量上分散的信息进行集中，主要对某几个综合性指标（主成分）进行探索性统计的分析方法。对DGGE图谱进行PCoA分析可以弥补相似性聚类分析受背景及其他无关因素影响的缺点，可以得到样品间是否存在差异，PCoA载荷量分析可以进而得到造成这种差异的原因［11，12］。对PCR-DGGE分离得到的条带进行克隆测序或杂交可以进一步准确鉴定细菌的种属。

1.2.5 肠道优势菌属实时荧光定量PCR检测 采用美国 Bio-Rad 公司 DNA Engine Opticon® 2 apparatus实时荧光定量PCR仪对肠道菌群进行定量，菌属特异性引物，见表 1。20μL 扩增体系由 10μL SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa），300nmol/L引物以及 1μL 模板 DNA组成。每个反应都重复3次。荧光定量PCR反应条件为：95℃ 预变性5min，95℃变性30s，退火30s，72℃延伸40s，执行40个循环；每个循环结束后维持81℃ 10s，以避免引物二聚体、二级结构，收集荧光信号。最后72℃延伸5min。每组引物的退火温度，见表1。每个荧光定量反应均以浓度101-108copies/μL的标准菌种16S rRNA基因片段的质粒DNA构建标准曲线［13］。

1.2.6 统计学分析 使用SPSS17.0对实时荧光PCR数据进行Fisher’s Exact Test 和one-way ANOVA进行统计学分析，每组数据分别以各自的“平均数±标准差”表示。样本基因的拷贝数以每克湿重样品中细菌数的对数值表示。

2 结果

2.1 肠道微生物群落组间和组内差异的DGGE图谱

图1-A是不同组别16S rRNA基因V3可变区PCR-DGGE图谱，条带反映了粪样中的优势菌群，其数量和位置的差异显示了各个组别和各个体之间菌群的多样性。对DGGE图谱进行标准化分析，将DGGE指纹图谱按迁移位置标号共有50条电泳条带。DGGE图谱经泳道相似性分析显示属于明显的2组（图1-A），其中婴幼龄组和孕期组、成年组可归为一组，其他3组归为一组，带谱间相似性均大于60％。婴幼龄组和孕期组相似性最高，大于67％。

表1 实时荧光定量PCR引物

对DGGE图谱进行数字化矩阵主成分分析，能够更直观地看到不同组别之间肠道菌群的差异。PCoA图上两点间距离越近表明主要菌群结构组成上的相似性越高，反之，则相似性越低。图1-B显示在主成分27.8％（X轴方向）和21.6％（Y轴方向）时，婴幼龄组和孕期组有明显的聚类。这些结果表明，处于哺乳期的婴幼龄个体与怀孕期个体具有相似的肠道优势菌群。

图1-C主成分载荷值分析得到导致主成分分析聚类的主要3条条带（图1-A中的A、B、C3条条带），对应DGGE图谱进行割胶、克隆、测序鉴定，比对结果显示它们分别是Ruminococcus bromii（98％，GenBank登录号DQ882649.1），Bifidobacterium dentium（98％，GenBank登录号HQ697642.1）和Lactobacillushelveticus（99％，GenBank登 录 号 HQ61664-3.1），百分数显示与GenBank比对后的序列相似性。

对DGGE图谱中50个电泳条带进行割胶，由于不能排除不同的碱基序列迁移到相同位置的可能，本研究共割胶62条，随后进行克隆，测序后用MOTHUR软件分析所有62个条带属于43个OTU。与GenBank序列进行比对后构建进化树显示所有62个条带、43个OTUs属于4个门：厚壁菌门（33/43 OTUs，47/62 DNA 序列），放线菌门（4/43 OTUs，8/62 DNA序列），拟杆菌门（5/43 OTUs，6/62 DNA序列）以及螺旋体门（1/43 OTUs，1/62 DNA序列），绝大多数条带都属于厚壁菌门（图2）。

2.2 不同年龄组恒河猴肠道优势菌种的定量结果

实时荧光定量结果（表2）显示在所有恒河猴肠道优势菌中，梭菌属和双歧杆菌最为丰富，将近109copies/g。肠球菌属最少，不到104copies/g。统计结果显示梭菌属clusters ⅪⅤ，肠球菌属和拟杆菌-普氏菌属组间差异明显（P＜0.01）。另外梭菌属clusters Ⅰ，clusters Ⅺ和乳酸杆菌也有较显著差异（P＜0.05）。

a：梭状芽孢杆菌分组参考文献［14］；b：乳酸杆菌包括乳酸杆菌属、片球菌属、明串珠菌属和魏斯氏菌属［15］；c：梭菌属clustersⅠ、梭菌属clusters Ⅺ、梭菌属clusters ⅪⅤ和柔嫩梭菌属均属于梭状芽孢杆菌

图1 16S rRNA基因V3区DGGE指纹图谱

组间统计分析显示同种细菌在不同年龄恒河猴肠道中的定值存在差异。其中青年恒河猴肠道中拟杆菌-普氏菌属基因拷贝数，与婴幼龄恒河猴相比有明显增多（P=0.049），梭菌属clusters Ⅺ则减少明显（P=0.021）。统计数据显示老年组恒河猴拟杆菌-普氏菌属细菌拷贝数，与成年组相比显著增多（P=0.000）。而孕期组恒河猴肠杆菌拷贝数明显高于同龄未怀孕亚成年和成年恒河猴（P=0.007和P=0.012）；梭菌属clusters Ⅺ拷贝数则明显低于同龄未怀孕亚成年和成年恒河猴（P=0.017和P=0.023）。图3显示，作为显示肠道健康水平标准的双歧杆菌和肠杆菌比值（B/E值）与同龄亚成年和成年组恒河猴相比，在孕期恒河猴组有明显的降低（P=0.002和 P=0.009）。

图3 不同年龄组双歧杆菌和肠杆菌比值（B/E值）的变化趋势

另外，q-PCR结果（表2）显示肠道梭状芽孢杆菌数量占有绝对优势，这与PCR-DGGE割胶条带测序结果（厚壁菌门，33/43 OTUs，47/62 DNA序列）一致。

3 讨论

PCR-DGGE方法最大优点是不依赖于培养过程，根据不同变性范围DNA片段的溶解性而使之分离，因此，近年来分子微生态学研究采用PCR-DGGE技术用以区分各微生境中的优势菌群，反映其菌群结构多样性。实时荧光定量PCR不仅能够监测整个PCR过程中产物的扩增情况，具有较高准确度，又因为该技术能够在很低模板浓度下进行准确定量，因而被广泛用于人类及其他动物肠道菌群方面的研究中。本研究首次采用这两项技术研究不同年龄和不同生理状态的中国恒河猴粪样菌群的多样性。研究结果表明，PCR-DGGE和实时荧光定量PCR技术在研究恒河猴肠道菌群多样性上非常有效。

图2 16S rRNA基因V3区进化树构建

本研究采集24只不同年龄、不同生理状况的恒河猴粪样，分析其肠道菌群的变化。研究结果显示，母乳喂养阶段的婴幼龄组恒河猴肠道DGGE图谱与孕期组恒河猴相似度高于67％，主成分分析显示二者出现明显聚类。主成分分析载荷值显示代谢相关功能菌Ruminococcus bromii，健康密切相关益生菌Bifidobacterium dentium和Lactobacillushelveticu为造成聚类的主要差异条带。有报道称婴幼儿肠道菌群处于紊乱状态［16，17］，Jeremy 等［18］报道婴儿体内肠道微生态处于紊乱的状态可能跟日常饮食和身体状况有关，但是机制尚不明确。而在孕期个体中，性激素可以通过胆汁分泌而分泌，接下来的细菌代谢导致苷配基和脱硫酸盐的产生，这两种成分会造成胆汁酸的重吸收，引发疾病［19-21］。还有很多关于健康女性在月经期和排卵期胃肠性疾病增多的报道，他们认为这些情况与雌激素和黄体酮水平的改变密切相关。关于胃肠型疾病的发生与性激素分泌的关系方面恰恰也有相反的报道，但是这些都清楚表明二者存在必然联系，而我们现在无法确定这种联系是不是导致婴幼龄组和孕期组聚类的原因［22，23］。很多研究证明肠道菌群状态与宿主的能量代谢有关，或许这也是导致聚类的原因。与之前的报道不同［24，25］，在我们的研究中未发现肠道菌群与性别之间的关系。

表2 不同年龄组中各个种属细菌实时荧光定量q-PCR结果

Q-PCR结果显示青年组与婴幼龄组相比，拟杆菌和梭菌clusters Ⅺ差异显著；老年组较之成年组，拟杆菌数量也显著增多；与同龄亚成年和成年个体相比，孕期组梭菌clusters Ⅺ和肠杆菌数量有显著差异，用以衡量肠道健康状况的双歧杆菌和肠杆菌比值（B/E值）［26］显著低下。这些对于因断乳等食性转换、生理性免疫功能低下、生理性激素水平变化等造成的恒河猴肠道疾病具有一定的指示意义。

本研究中的母乳喂养期的婴幼龄与孕期恒河猴肠道主要菌群特点相似尚属首次发现，接下来我们会有针对性地展开研究，同时对患病个体样品和健康个体进行比较，以期发现肠道菌群变化与疾病的潜在发生之间的规律。

4 结论

（1）以梭杆菌为主的厚壁菌门细菌是恒河猴肠道的主要优势菌群，另外也有放线菌门、拟杆菌门和螺旋体门细菌的分布。

（2）恒河猴婴幼龄组和孕期组出现明显聚类，很可能与激素分泌密切相关。主成分载荷值显示代谢相关功能菌R.bromii，健康密切相关益生菌Bif.dentium和Lac.helveticus为造成聚类的主要差异条带。

（3）处于食性转换期的青年组、免疫力下降的老年组以及体内激素水平发生变化的孕期组恒河猴肠道主要菌群水平有不同程度的改变。作为显示肠道健康水平标准的双歧杆菌和肠杆菌比值（B/E值）与同龄亚成年和成年组恒河猴相比，在孕期恒河猴有明显的降低。

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