应力环境下破骨细胞碳酐酸酶Ⅱ的基因表达

董强 夏茜 周建奖等

[摘要] 目的 研究流体切应力条件下大鼠破骨细胞碳酐酸酶Ⅱ（CaⅡ）mRNA的表达变化，探讨应力环境下大鼠

破骨细胞的功能活动情况。方法 采用1，25-（OH）2D3/地塞米松诱导SD大鼠骨髓细胞，抗酒石酸酸性磷酸酶染色和扫描电镜鉴定破骨细胞，0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）进行细胞纯化。对破骨细胞施加不同力值和作用

时间的流体切应力，采用实时荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测CaⅡ mRNA的表达。结果 随着力值的增加和作用时间的延长，破骨细胞CaⅡ mRNA的表达量分别呈下降趋势（P<0.05）。结论 在一定范围的流体切应

力作用下，破骨细胞CaⅡ mRNA的表达受到抑制，表达水平与力值大小和加载时间分别存在负相关关系。

[关键词] 破骨细胞； 流体切应力； 骨吸收； 碳酐酸酶Ⅱ； 聚合酶链反应

[中图分类号] R 318.01 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.023

功能载荷下的种植体与周围骨组织形成和保持良好的骨性界面，是口腔种植义齿长期成功使用的关键要素。在复杂的咬合力和肌力等各种力学环境下，种植体周围的骨组织不断进行改建。在各种应力环境下，骨组织和骨细胞发生骨吸收和骨形成的机制仍未能完全明确。骨吸收是多阶段的过程。破骨细胞首先通过泌酸使骨组织脱矿，然后降解有机质。碳酐酸酶Ⅱ（carbonic anhydrase Ⅱ，CaⅡ）催化CO2水解成碳酸氢盐和氢离子，为泌酸提供主要的质子来源，在调节破骨细胞的胞内pH值和在胞外不同的pH值水平促进吸收的活动中发挥关键作用[1-2]。

目前，对流体切应力作用下大鼠破骨细胞CaⅡ表达水平的相关研究报道很少。本研究采用平行平板流体切应力加载装置，对纯化后的SD大鼠破骨细胞施加不同力值和作用时间的流体切应力，采用实时荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应（reverse transcrip-

tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测CaⅡ mRNA的表达水平，探讨应力环境下大鼠破骨细胞功能活动的变化情况。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠（清洁级，贵阳医学院动物中心提供）；

α-MEM培养基（Gibco公司，美国）；胎牛血清（Hy-clone公司，美国）；地塞米松、1，25-（OH）2D3、青霉素-链霉素（Sigma公司，美国）；Trizol Reagent、

SupperScript Ⅱ逆转录试剂盒、DNase Ⅰ（Invitrogen公司，美国）；聚合酶链反应（polymerase chain reac-tion，PCR）试剂（MBI公司，立陶宛）；引物及Taqman荧光探针（上海闪精生物制剂有限公司）。

CO2恒温培养箱、细胞培养箱（Sanyo公司，日

本）；倒置相差显微镜（OLYMPUS公司，日本）；除

菌过滤器（Gibco公司，美国）；血细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；FTC2000荧光定量PCR仪（枫岭公司，加拿大）；流体切应力加力系统

（专利号：200420034438）。

1.2 方法

1.2.1 破骨细胞的原代培养、鉴定和纯化 以1，25-（OH）2D3/地塞米松诱导10～12 d龄SD大鼠四肢长骨骨髓细胞，培养第7天，通过抗酒石酸酸性磷酸酶（tar-

trate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色[3]和扫

描电镜（scanning electron microscope，SEM）鉴定破骨

细胞，用0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸（ethy-

lenediamine tetraacetic acid，EDTA）进行细胞纯化[4]。

1.2.2 破骨细胞的体外加力 按加力时间和力值大小的不同，分为2组，具体如下。1）力值组：分别对纯化后的破骨细胞施加0（对照组）、0.9、3.2、8.9、

18.7 dyne·cm-2的流体切应力，时间为30 min；2）时

间组：分别对纯化后的破骨细胞施加3.2 dyne·cm-2的流体切应力，时间各为0（对照组）、15、30、60 min。

每组实验进行3次。呈单层排列的细胞受到切应力的计算公式为[5]：τ=6μQ/wh2。其中μ为培养基表观黏

度，Q为流量，w为流槽宽度，h为流槽高度。由血液流变仪测出α-MEM培养基37 ℃时μ=0.752×10-3 Pa·s。在实验加力结束时用秒表和量筒测量培养基流量。

将流体切应力加力装置[6]按设计要求安装。系统中加入无血清的α-MEM培养液（37 ℃）200 mL，启动

蠕动泵，保持蠕动泵提供的流量恒定（约50 mL·min-1）。培养7 d的破骨细胞纯化后，将载玻片放入流室的矩形流槽内，按分组情况分别对纯化后的破骨细胞施加流体切应力。

1.2.3 实时荧光定量巢式RT-PCR 采用Trizol法提取样本总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳进行检验。利用cDNA反转录试剂盒建立反应体系，合成cDNA。根据Genebank中检索到的CaⅡ mRNA基因全序列，结合标准荧光定量PCR引物设计原则，进行CaⅡ mRNA内、外侧引物和管家基因GAPDH的Taqman探针的设计（表1）。引物和探针由上海生物公司合成并检测。将cDNA产物进行巢式PCR，第一轮PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s、55 ℃复性30 s、72 ℃延伸40 s，循环15次；72 ℃延伸5 min。第二轮PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s、55 ℃复性30 s、72 ℃延伸40 s，循环35次；72 ℃延伸

5 min。对第二轮PCR产物进行2%琼脂糖电泳，检验引物设计合成无误后，进行实时荧光定量PCR，反应体系为：10×PCR缓冲液3 μL、25 mmol·L-1 MgCl2 3 μL、25 mmol·L-1 dNTPs 0.36 μL、10 μmol·L-1 CaⅡ内侧上下游引物各1 μL、10 μmol·L-1 GAPDH探针

1 μL、5 U·μL-1 Taq酶0.3 μL、ddH2O 15.34 μL、巢式PCR产物5 μL。扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s，循环45次。

将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数进行分析，绘制相应的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到阈值时的扩增循环数（Ct值），根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数

值作图，得出该样品的标准曲线。在此反应系统中，荧光强度的增加与模板量的增加成正比，荧光强度的变化可反应模板产物量的变化。

根据热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度，确定Ct值，记录实验组和对照组CaⅡ和管家基因GAPDH的Ct值。假设实验组相对于对照组中CaⅡ的相对表达量为Z，并根据公式计算Z=2-△△Ct，△△Ct=（CtCaⅡ-CtGAPDH）实验组-（CtCaⅡ-CtGAPDH）对照组[7]。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.0软件进行统计分析，对各组相对拷贝数进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 破骨细胞的原代培养、纯化和鉴定

倒置显微镜下观察可见，多核破骨样细胞呈煎蛋形、漏斗形等不规则形态，有伪足和丝状突起，可含数十个细胞核，核在细胞内分布无规律。在细胞培养7 d时，加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化6～8 min后，载玻片上大部分单核细胞脱落，纯化率可达90%（图1）。TRAP染色的多核破骨样细胞胞浆呈红色阳性反应，胞核阴性（图2）。SEM观察可见，

吸收陷窝呈圆形、椭圆形或不规则形，边界清晰，底面粗糙，有纤维样基底（图3）。

2.2 RNA分析和扩增效率分析

提取的总RNA行1%琼脂糖凝胶电泳，28S、18S条带清晰可见，无DNA污染条带，无明显降解条带。常规PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，CaⅡ和GAPDH条带清晰，未见明显的杂带，相应的碱基数目正确（图4）。

以样品拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，分别拟合CaⅡ和GAPDH的标准曲线（图5）。其回归

系数均大于0.96，拟合满意。利用标准曲线以公式计算扩增效率Ex[7]：Ex=101/-k（k为标准曲线的斜率），CaⅡ与GAPDH的Ex值近似相同，约为2.1。

2.3 不同流体切应力作用下CaⅡ mRNA的表达

力值组中，施加0、0.9、3.2、8.9、18.7 dyne·cm-2流体切应力后CaⅡ mRNA相对拷贝数分别为（1 000±0.00）×10-3、（18.98±17.02）×10-3、（0.98±0.00）×10-3、（0.31±0.19）×10-3、（0.02±0.00）×10-3。各加力样本CaⅡmRNA的相对拷贝数均比对照组（0 dyne·cm-2）低。随着力值的增加，各组样本CaⅡ mRNA相对拷贝数的均数值逐渐减少，组间存在显著性差异（P<0.05）。

在时间组中，施加流体切应力0、15、30、60 min后CaⅡ mRNA相对拷贝数分别为（1 000±0.00）×10-3、（78.15±46.85）×10-3、（0.98±0.00）×10-3、（0.55±0.43）×10-3。各加力样本CaⅡ mRNA的相对拷贝数均比对照组（0 min）低。随着加力时间的延长，各组样本CaⅡ mRNA相对拷贝数的均数值逐渐减少，组间存在显著性差异（P<0.05）。

3 讨论

维持局部酸性微环境是破骨细胞发挥骨吸收功能的重要条件。CaⅡ属含锌金属酶家族，分布广泛，几乎在所有组织或器官的某些细胞的胞质中均有表达。在破骨细胞的细胞质中，通过与HCO3-/Cl-交换的联合作用，CaⅡ为维持破骨细胞细胞质pH提供了主要的质子来源[8]，而破骨细胞外pH的降低也可能

增强CaⅡ的表达。CaⅡ表达受到抑制，将直接影响破骨细胞的骨吸收活性。

在体外流体的相关研究中，由于应用不同的基底、流室腔、细胞准备的差异（有无血清、营养、融合等）等因素而复杂化[9]。除了切应力的性质和大小，流体的空间分布也对其效应有重要的影响[10]。平行

平板流动腔提供的切应力可以人为的控制，量化较准确，使各种细胞的体外流体力学研究相对容易和可行。但由于流室腔的几何结构与骨组织的陷窝-小管网络系统不同，流体的空间分布也不同，其介导的切应力的效应可能与体内有差异。建立可量化的模拟陷窝-小管网络系统的体外实验系统，将有力地促进骨细胞相关流体力学的研究，也是骨改建机制研究的努力方向之一。

本实验采用平行平板流体切应力加载系统，以无血清的α-MEM培养基作为流动介质，对胰蛋白酶/EDTA消化法纯化后的1，25-（OH）2D3/地塞米松诱导培养的SD大鼠破骨细胞，施加不同力值和作用时间的流体切应力，用实时荧光定量巢式RT-PCR检测CaⅡ mRNA的表达。结果显示，随着力值的增加和作用时间的延长，CaⅡ mRNA的表达量呈下降趋势，各组样本间存在显著性差异（P<0.05）。说明在一定范

围内的稳定流体切应力（0.9～18.7 dyne·cm-2，30 min；

3.2 dyne·cm-2，15～60 min）作用下，破骨细胞CaⅡ

mRNA的表达受到抑制，并且表达水平与力值的大小和加载时间分别存在负相关关系。本实验的结果与相关研究报道的作用趋势一致，提示流体切应力不仅抑制破骨细胞的形成[11]，还可能通过改变其胞

内关键的功能性酶（如CaⅡ）的转录水平而影响骨吸收，相关机制有待进一步的研究。

[参考文献]

[1] Schwartz GJ， Brown D， Mankus R， et al. Low pH enhances ex-

pression of carbonic anhydrase II by cultured rat inner medullary

collecting duct cells[J]. Am J Physiol， 1994， 266（2 Pt 1）：C508-

C514.

[2] Meghji S， Morrison MS， Henderson B， et al. pH dependence of

bone resorption： Mouse calvarial osteoclasts are activated by aci-

dosis[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2001， 280（1）：E112-

E119.

[3] Mostafa YA， Meyer RA Jr， Latorraca R. A simple and rapid me-

thod for osteoclast identification using a histochemical method for

acid phosphatase[J]. Histochem J， 1982， 14（3）：409-413.

[4] 董强， 梁星， 陈悦， 等. 胰酶消化法纯化诱导不同年龄段SD大鼠

骨髓破骨细胞的体位培养[J]. 华西口腔医学杂志， 2006， 24（4）：

350-352， 361.

Dong Qiang， Liang Xing， Chen Yue， et al. Isolation of bone mar-

row-derived rat osteoclast-like cells with the digestion of trypsin

[J]. West China J Stomatol， 2006， 24（4）：350-352， 361.

[5] Frangos JA， McIntire LV， Eskin SG. Shear stress induced stimu-

lation of mammalian cell metabolism[J]. Biotechnol Bioeng， 1988，

32（8）：1053-1060.

[6] 陈明， 梁星， 王魏新， 等. 可用于体外培养破骨细胞的流体剪应

力系统[J]. 生物医学工程学杂志， 2005， 22（2）：288-292.

Chen Ming， Liang Xing， Wang Weixin， et al. A biomechanical

system that can apply fluid shear stress to osteoclast-like cells in

vitro[J]. J Biomed Eng， 2005， 22（2）：288-292.

[7] Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data

using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））

Method[J]. Methods， 2001， 25（4）：402-408.

[8] Oksala N， Levula M， Pelto-Huikko M， et al. Carbonic anhydrases

Ⅱ and ⅩⅡ are up-regulated in osteoclast-like cells in advanced

human atherosclerotic plaques-Tampere Vascular Study[J]. Ann

Med， 2010， 42（5）：360-370.

[9] Stevens HY， Frangos JA. Bone cell responses to fluid flow[J]. Me-

thods Mol Med， 2003， 80：381-398.

[10] Balcells M， Fernández Suárez M， Vázquez M， et al. Cells in flui-

dic environments are sensitive to flow frequency[J]. J Cell Physiol，

2005， 204（1）：329-335.

[11] Kulkarni RN， Bakker AD， Everts V， et al. Inhibition of osteo-

clastogenesis by mechanically loaded osteocytes： Involvement of

MEPE[J]. Calcif Tissue Int， 2010， 87（5）：461-468.

（本文编辑 杜冰）