压应力对小鼠单核细胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12、抗酒石酸酸性磷酸酶表达的影响

黄生高 凌天牖 钟孝欢等

[摘要] 目的 探讨压应力对小鼠单核细胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12（DAP12）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）表

达的影响。方法 以小鼠单核细胞RAW264.7为研究对象，采用四点弯曲体外细胞加载装置加载压应力0、3、6、12 h，分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法检测DAP12、TRAP mRNA和DAP12蛋白的表达情况。结果

小鼠单核细胞RAW264.7经破骨细胞培养液培养后，体积变大，核数目增多，TRAP染色阳性。受压应力刺激后，DAP12、TRAP mRNA及DAP12蛋白表达随加力时间延长而增加（P<0.05）。结论 小鼠单核细胞RAW264.7经破骨细胞培养液培养后成功向破骨细胞转化，转化细胞受压应力刺激活化过程中存在DAP12高表达。

[关键词] DNAX活化蛋白12； 抗酒石酸酸性磷酸酶； 压应力； 破骨细胞

[中图分类号] Q 78 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.008

破骨细胞由其前体细胞分化而来，在其分化并行使功能的过程中受多条信号传导通路调控。其中免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）信号传导通路日益受到人们的重视。已知DNAX活化蛋白12（DNAX-activa-ting protein 12，DAP12）是骨髓来源细胞系ITAM的主要衔接蛋白，在ITAM信号通路中起着枢纽作用。但其在破骨细胞受机械力刺激后的表达及作用尚不清楚。本实验拟探讨在小鼠单核细胞株RAW264.7受压应力的刺激后，DAP12、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）mRNA及DAP12蛋白的表达情况，为进一步研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠单核细胞株RAW264.7（ATCC公司，美国），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），兔抗人

DAP12多克隆抗体、羊抗人β-actin多克隆抗体、辣根过氧化酶HRP标记的兔抗羊IgG（Santa Cruz公司，

美国），小鼠重组可溶性核因子κB受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，

RANKL）、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage co-

lony-stimulating factor，M-CSF）（Peprotech公司，美国），TRIzol、逆转录试剂盒、TaKaRa TaqTM PCR

试剂套装、高糖DMEM培养基（Invitrogen公司，美

国），TRAP染色试剂盒（Sigma公司，美国），BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司，美国），聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（Millipore公司，美国）等。

1.2 主要设备

SFEG AIR超净工作台（苏州苏净公司），四点

弯曲体外细胞加载装置（四川大学设计，专利号：

zL01256849.x），Forma Scientific CO2培养箱（Shellab公司，美国），Olympus IX50相差倒置显微镜（Oly-mpus公司，日本），Nikon YS100光学显微镜（Nikon公司，日本），DU530紫外分光光度计（Backman公

司，美国），PCR system 2700型PCR扩增仪（美国应用生物系统公司），DYY-Ⅱ、DYY-Ⅲ型凝胶电泳仪（北京六一仪器厂），GelDoc 2000凝胶成像系统

（Bio-Rad公司，美国）等。

1.3 细胞分组和加力

1.3.1 加力板的准备 将750 mL斜颈培养瓶从中间剖开，取细胞培养常用的底面，打磨成8.0 cm×3.0 cm大小的两块，周缘平滑四角圆钝，以避免加力过程中的应力集中。使用清水洗净加力板，放入酸性洗液中过夜后用三蒸水反复冲洗数次，再放入75%乙醇中浸泡24 h，三蒸水浸泡12 h后在56 ℃烘箱中烤干，最后在超净工作台紫外消毒灯下双面照射灭菌（各12 h）后接种细胞。

1.3.2 加力前细胞的准备 将常规传代后的RAW-264.7细胞以密度为每毫升1×104个接种于加力板上（实验组和对照组同时种板）。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱培养，1 d后细胞绝大部分贴壁，更换为破骨细胞培养液（DMEM全培养液含20 ng·mL-1的M-CSF和50 ng·mL-1的RANKL），继续培养6 d。

1.3.3 细胞加力 采用四点弯曲体外细胞加载装置对接种在加力板上的RAW264.7细胞进行压应力刺激。本实验设实验组与对照组，实验组使用的压应力频率为0.5 Hz，大小为2 500 μtrain，在0、3、6、12 h不同时间段，使细胞在平行于贴壁方向上发生单轴压缩应变；对照组不加力。对照组和实验组各包含3个实验样本，每组的3个样本均来自同一瓶计数的细胞，以相同的细胞密度和细胞量接种在加力板上。除加力时间与是否加力影响因素外，其他条件基本一致。加力结束后分别收获细胞，进行后续相关实验。

1.4 半定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcrip-

tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测

DAP12、TRAP mRNA的表达

1.4.1 细胞总RNA的提取及纯度测定 按照TRIzol试剂盒说明提取细胞总RNA。

1.4.2 逆转录生成cDNA第一链 取1 μg总RNA，按逆转录试剂盒说明进行逆转录，生成20 μL cDNA第一链。

1.4.3 PCR扩增 实验引物序列具体如下。DAP12上游引物序列：5-GGCTGGGATTGTTCTGGGTGAC-3，下游引物序列：5-CCGCTGATGGGCATAGAG-TGG-3。TRAP上游引物序列：5-ACACAGTGAT-GCTGTGTGGCAACTC-3，下游引物序列：5-CC-AGAGGCTTCCACATATATGATGG-3。GAPDH上游引物序列：5-AAGCCCATCACCATCTTCCA-3，下游引物序列：5-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3。

按照TaKaRa TaqTM PCR试剂盒说明生成20 μL PCR产物。PCR扩增条件如下。DAP12：94 ℃预变性5 min，开始循环94 ℃ 20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共35个循环，72 ℃彻底延伸10 min，4 ℃保存。TRAP：94 ℃预变性5 min，开始循环94 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，共35个循环，72 ℃彻底延伸10 min，4 ℃保存。GAPDH：95 ℃预变性

5 min，开始循环95 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环，72 ℃彻底延伸10 min，4 ℃保存。

1.4.4 PCR产物凝胶电泳 各取20 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶上电泳（电压100 V），凝胶成像系

统照相并用Quantity one-4.0.3凝胶图像分析软件测量其积分光密度值（integral optical density value，

IOD）。分别计算DAP12 mRNA、TRAP mRNA与GAPDH mRNA RT-PCR产物电泳带IOD值之比。

1.5 蛋白免疫印迹法检测DAP12蛋白的表达

首先应根据欲分离的蛋白质相对分子质量大小选择适合的凝胶浓度。本研究分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%。常规提取蛋白质，并测定浓度。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析。实验结果以mean±SD表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠单核细胞RAW264.7的培养及其向破骨细

胞分化

体外培养的小鼠单核细胞RAW264.7在10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中生长良好。以密度为每毫升1×104个进行接种，2～12 h细胞贴壁，5～6 d细胞长满培养瓶。倒置显微镜下可见培养瓶培养的贴壁RAW264.7细胞大多数呈类圆形，少量细胞呈不规则形态，有伪足，一般含1～2个细胞核（图1）。加入破骨细胞培养液培养4 d后，可见多核细胞，胞内有3～7个核，细胞大小不一，形态各异，TRAP染色阳性；培养第7天，TRAP染色阳性多核细胞增多，体积增大，核数目增多，表明RAW264.7细胞向破骨细胞转化（图2）。

2.2 力刺激对RAW264.7细胞DAP12、TRAP mRNA

表达的影响

2.2.1 RNA纯度和电泳结果 采用紫外分光光度计测量RNA的纯度，A260 nm/A280 nm比值均在1.7～2.0，显示RNA的纯度较高。琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S和5S 3条带，无明显杂带（图3）。

2.2.2 PCR产物电泳结果 受压应力刺激后，实验组DAP12、TRAP mRNA表达随加力时间延长而逐渐增加，对照组无明显变化（图4）。随着压应力刺

激时间的延长，RAW264.7细胞DAP12 mRNA表达逐渐增加，3 h时增加不明显，6 h后开始显著增加。实验组加力6、12 h与加力0 h比较，差异有统计学意义（P<0.05）；加力6、12 h，实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图5）。刺激3 h后TRAP mRNA表达虽然轻微上调，但无显著差别，随着压应力刺激时间的延长，TRAP mRNA表达逐渐升高（6、12 h）。实验组加力6、12 h与0 h比较，差异有统计学意义（P<0.05），加力6、12 h，实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图6）。

2.3 压应力刺激对RAW264.7细胞DAP12蛋白表达

的影响

压应力刺激RAW264.7细胞3 h后，DAP12蛋白表达水平增加并不明显，随着压应力刺激时间的延长（6、12 h），DAP12蛋白表达水平逐渐增高。实验组加力6、12 h与0 h比较，差异有统计学意义（P<

0.05），加力6、12 h，实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图7、8）。

3 讨论

3.1 细胞和应力加载装置的选择

体外培养原代的破骨细胞难度很大，成功率较低。小鼠单核细胞RAW264.7在适宜浓度的破骨细胞培养液作用下，可分化成多核的、TRAP染色阳性的、具有骨吸收功能的破骨细胞。重复性好，结果稳定[1-2]。本实验参考国内外学者的培养经验，采用20 ng·mL-1的M-CSF和50 ng·mL-1的RANKL联合培养RAW264.7细胞，可诱导其向破骨细胞分化，能较好地满足实验对细胞量要求较大，且细胞贴壁良好，符合实验中需加力的要求。

人体日常活动引起骨骼细胞的应变约为400～

2 000 μstrain，而在剧烈活动时细胞的应变约为

4 000 μstrain[3]。本实验采用2 500 μstrain的应变符合体内细胞的生理应变范围。除了应变大小之外，机械外力刺激的频率也可对骨骼细胞产生影响[4-5]，本实验采用0.5 Hz频率的压应力可尽量的减少加力过程中培养液对细胞产生的流体剪切力[2]。四点弯曲细胞力学加载仪采用梁变形原理，利用数控步进电机使细胞培养板发生应变，使贴附在培养板上的细胞产生形变，从而间接地对细胞产生精确、恒定的单轴应力。可满足多种应变需求，是一种可靠且重复性较高的细胞体外力学加载仪。而且该装置是通过细胞加力板细胞培养面面积的改变而对其表面培养的细胞进行挤压，故与其他一些加力装置相比更能模拟体内压力侧牙槽骨破骨细胞的受力情况。

3.2 压应力刺激对破骨细胞分化的影响

TRAP是破骨细胞特有的标志酶，是破骨细胞分化的标记物，也与破骨细胞骨吸收功能密切相关[6-7]。

检测TRAP的表达情况可反映RAW264.7细胞的功能状态。

本研究发现：在RANKL和M-CSF联合作用下，压应力刺激可提高RAW264.7的破骨细胞特征，而对照组这种变化并不明显。机械外力的这种诱导能力与其对细胞刺激的时间长短有关，刺激时间过短，并不能引起破骨细胞的高度活化，只有机械外力刺激一定的时间后破骨细胞的活化才变得更加明显。这与临床上正畸牙的移动情况有些相似，短暂的力学刺激（咬合力或短暂的正畸力等）作用于牙齿并不能引起牙齿的移动，只有持续的正畸力才能引起牙齿移动。

3.3 压应力刺激对RAW264.7细胞DAP12 mRNA和

蛋白表达的变化

破骨细胞来源于骨髓造血系统的单核细胞系，破骨细胞的分化与成骨细胞密切相关。成骨细胞可表达RANKL，通过细胞间接触与破骨前体细胞胞膜上的RANK受体结合，激活RANK介导的信号传导通路来诱导破骨前体细胞向破骨细胞分化[8]。近年来

的研究表明破骨细胞的分化除了要激活与RANKL和 M-CSF相对应的细胞膜受体及相对应的细胞内信号通路外，还需要其他的信号通路参与调节[9-10]。ITAM

信号传导通路在骨代谢平衡或病理性骨改建（像炎

症性骨吸收等）过程中起重要调节作用。DAP12作为ITAM信号传导通路的一种主要衔接蛋白，其介导的信号传导通路在破骨细胞分化过程中发挥重要作用。正畸牙移动是个炎症反应过程[11]，这可能引起局部

的免疫反应。DAP12介导的信号传导通路作为在炎症性骨吸收过程中发挥重要作用的信号通路是否也参与调节正畸移动过程中牙槽骨的改建和调节机械力诱导破骨细胞分化，目前尚未清楚。

本研究发现压应力在刺激RAW264.7细胞后，DAP12 mRNA表达随着压应力刺激时间的延长逐渐增加。表明DAP12可能参与了破骨细胞对机械力刺激的应答反应。如前所述，2 500 μtrain的压应力随着作用时间的增加可逐步上调破骨细胞分化标记物TRAP mRNA的表达，这与DAP12 mRNA表达的趋势类似，故笔者推测DAP12可能参与调节机械压应力诱导RAW264.7细胞的破骨细胞表征的过程。mRNA是从转录水平进行研究，它并不能完全体现蛋白质的表达水平。蛋白质是生理功能的执行者，对蛋白质的研究更能阐明各种生理或病理条件下生命现象的变化机制。本实验发现在受到压应力刺激3 h后，DAP12蛋白表达水平增加并不明显；随着压应力刺激时间的延长（6、12 h），DAP12蛋白表达水平逐渐增高。这与mRNA的变化基本相似。综上所述，受到压应力刺激后，RAW264.7细胞DAP12 mRNA和蛋白表达发生改变，提示DAP12参与调节机械力学刺激诱导破骨细胞的分化。

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（本文编辑 杜冰）