早期糖尿病大鼠视网膜中TSP-1和VEGF的动态变化及意义

江雪丰 周希瑗

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病严重的微血管并发症之一, 是导致双眼不可逆性盲的重要原因, 其发病机制比较复杂, 受多种血管刺激因子和抑制因子调控。其中血小板反应蛋白-1 (thrombospondin-l , TSP-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)是目前发现的作用较强的眼部新生血管抑制因子和促进因子。作者用免疫组织化学方法检测TSP-1 和VEGF蛋白质在大鼠模型中的表达及变化, 以希望对早期DR的发病机制有进一步的了解。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及模型建立 实验用封闭群雄性Wistar大鼠40只, 体质量200～260 g, 将链脲佐菌素(streptozotocin,STZ;Sigma公司)按60mg·kg-1腹腔内注射, 注射后48 h检测尿糖和血糖。血糖浓度达16.65 mmol·L-1, 尿糖达+++以上为模型建立成功。成模后每月检测一次鼠尾血糖。实验组10只,另取正常对照组10只。正常组大鼠腹腔注射0.1mol·L-1柠檬酸缓冲液。

1.2 眼球标本的取材和制片 各组大鼠3个月时以10%水合氯醛腹腔麻醉。麻醉成功后灌注多聚甲醛约300 ml。摘除眼球, 浸泡固定24 h。常规浸蜡, 包埋, 备用。将制好的眼球标本切片, 用于免疫组织化学染色。

1.3 各组大鼠视网膜TSP-1和VEGF表达的检测 采用免疫组织化学SP-9002法, 小鼠抗大鼠TSP-1单克隆抗体购自美国NeoMarkers公司, VEGF单克隆抗体、SP-9002免疫组织化学试剂盒及显色试剂盒购于中山生物工程有限公司。操作步骤为：切片脱蜡至水；体积分数3%H2O2滴加切片上,室温孵育15 min；微波修复抗原15 min, 滴加正常山羊血清封闭非特异性抗原15 min；滴加TSP-1一抗(稀释度为1：100)或VEGF一抗(稀释度为1：300), 4℃过夜；生物素化二抗工作液15 min;辣根酶标记链霉素卵白素工作液15 min,DAB显色, 复染, 脱水, 透明, 封固镜检。阴性对照实验以磷酸缓冲液代替一抗。

1.4 统计学方法 采用Image-Pro Plus 图像分析系统测定视网膜TSP-1和VEGF的积分光密度,数据以x-±s表示, 采用SPSS13.0统计学软件进行t检验, 以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组TSP-1免疫组织化学染色结果 光镜观察正常组中TSP-1蛋白质的阳性反应表达分布于视网膜的内界膜、内丛状层、内核层、外丛状层, 呈深棕黄色；糖尿病大鼠视网膜TSP-1蛋白质的阳性表达较正常组显著降低, 尤其在内丛状层、外丛状层呈极微弱的阳性表达见表1。

2.2 各组VEGF免疫组织化学染色结果 光镜观察 正常组大鼠VEGF阳性反应在视网膜分布于内核层及节细胞层,胞浆呈棕黄色, 胞核未显色。糖尿病组大鼠视网膜中VEGF蛋白质的阳性表达分布于内核层及节细胞层, 表达增强, 胞浆呈深棕黄色, 内核层阳性反应细胞增多, 见表1。

表1 TSP-1和VEGF积分光密度在各组视网膜中的数据分析

3 讨论

糖尿病视网膜病变(DR)是常见致盲性疾病, 基本病理过程表现为微循环障碍, 主要病理改变为视网膜血管渗透性增加, 从而促进视网膜缺血缺氧及新生血管形成, 最终导致视功能损害［1］。近年来的研究表明, 其中血小板反应蛋白-1(TSP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)是重要的眼部新生血管抑制因子和促进因子, 它们在眼底新生血管生成过程中起着重要作用［2］。TSP-1是可由多种细胞分泌的抗新生血管因子,是一种重要的多肽类内源性血管新生抑制物［3］。TSP-l还可与细胞表面受体、蛋白酶、及细胞外基质发生作用, 可刺激细胞增生, 并参与胚胎发育、组织分化、细胞迁移、血管生成、炎症以及凝血与纤溶等病理生理过程, 其已被公认为一种有效的内源性血管生成抑制因子, 它可诱导内皮细胞凋亡,这种抑制作用可被抗TSP-1的单克隆抗体所中和, 并在氧诱导的缺血性视网膜病变过程中起关键作用, 视网膜前新生血管减弱与TSP-1的表达增加有关［4］, 研究发现在老年性黄斑病变中Bruch's膜和脉络膜中TSP-1的降低可能会促使CNV的形成［5］。VEGF作为一种强烈的血管通透性因子和血管内皮细胞分有丝裂原, 在DR的发生发展过程中起着至关重要的作用［6］。

本研究发现TSP-1蛋白质在正常组大鼠视网膜中内界膜、内丛状层、内核层、外丛状层有表达, 呈深棕黄色强阳性反应。在糖尿病组TSP-1表达量减少, 内、外丛状层只见极微弱的表达, 说明在DR早期视网膜缺血缺氧下调了TSP-1的表达。研究结果还显示, 正常组VEGF有少量表达,在糖尿病组中VEGF表达呈升高, 结果与TSP-1表达相反。DR在高糖状态下, 视网膜微循环障碍引起的组织缺血缺氧下调TSP-1的表达, 致使TSP-1不能有效拮抗VEGF的作用, 促进内皮细胞增殖, 增加血管通透性进而诱发新生血管的生成。因此TSP-1与VEGF在早期DR过程中都有表达且呈动态过程,它们的表达失衡在DR早期过程中可能起重要调控作用, 二者具体调控机制及相互作用关系还有待进一步研究。

［1］Armulik A, Abramssion A, Betsholtz C.Endothlial/pericyte interaction.Circ Res, 2005, 97(6):512-523.

［2］郝胜利, 徐延山, 袁佳琴.糖尿病视网膜病变的药物治疗．国际眼科纵览, 2006:30(1):58-62.

［3］Hiacott P, Paraoan L, Choudhary A, etal.Thrombospondin 1,thrombospondin2 and the eye.Prog Retin Eye Res, 2006, 25(1):1-18.

［4］Wu Z, Wang S, Sorenson CM, et al．Attenuation of retinal vascular development and neovascularization in transgenic mice over-expressing thrombospondin-I in the lens.Dev Den, 2006,235(7):1908-1920.

［5］Uno K, Bhutto IA, McLeod DS, et al, Impaired expression of thwmbospondin-1 in eyes with age related macular degeneration.Br J Ophthalmol, 2006,90(1):48-54

［6］Takagi H, Oh H, Otani A, et al.Molecular mechanisms of retinal neovascularization in diabetic retinopathy.International Congress series, 2004, 1262:160-163.