CAV1基因在五种白血病细胞中的表达

马 微 李 丽 杨永旭 葛堂栋 朴金花 张鹏霞

(牡丹江医学院研究生处，黑龙江 牡丹江 157011)

细胞癌变的本质是信号转导通路失调导致的细胞无限增殖〔1〕。伊马替尼等药物对慢性粒细胞性白血病(CML)治疗获得的成功证明了靶向治疗白血病是重要的发展方向〔2，3〕。Caveolin-1(CAV1)是caveolae的主要结构蛋白，位于信号通路交联中心，与肿瘤的发生发展密切相关。CAV1基因的突变缺失、启动子区域CpG岛位点的高密度甲基化〔4〕、CAV1-α亚型中Y14磷酸化的异常〔5〕、上游转录因子及信号蛋白的异常启动激活CAV1或上调其表达量均可引起肿瘤的发生。本实验选取具有代表性的五种白血病细胞株，从基因、蛋白水平检测CAV1的表达，探讨CAV1在白血病中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Reverse Transcriptase M-MLV、SYBR Premix Ex Taq购于 TaKaRa公司，Trizol试剂购于 Invitrogen公司，M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent试剂盒、蛋白定量试剂盒Pierce BCA Protein Assay Kit、化学发光法(ECL)发光试剂盒购于Pierce公司，聚氟偏乙烯(PVDF)膜购于MILLIPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与收集 SUP-B15、HL-60、THP-1、K562白血病细胞为本实验室保存，人慢性淋巴细胞白血病原代肿瘤细胞采用磁珠分选分离收集，人正常白细胞(WBC)由本实验室常规分离收集。

SUP-B15、HL-60、THP-1、K562 细胞常规悬浮培养，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃，5%CO2培养箱，每2～3 d传代1次。1 000 r/min离心收集细胞沉淀。

1.2.2 总RNA的提取及cDNA的制备 离心收集洗涤细胞1×107个，加入1 ml Trizol试剂，反复吹打后12 000 r/min，4℃离心5 min，将上清移至经DEPC水处理过的1.5 ml无菌离心管中进行总RNA的抽提。紫外分光光度计测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。采用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，反应体系为 RNA/引物变性液10 μl，5×M-MLV 缓冲液4 μl，dNTP Mixture 1 μl，Ribonuclease Inhibitor 1 μl，RTase MMLV 1 μl，RNase free dH2O 加至 20 μl，42℃保温 1 h，70℃保温15 min后冰上冷却。

1.2.3 细胞总蛋白提取 使用M-PER人蛋白抽提试剂盒，每2×107个细胞加入1 ml M-PER试剂，反复吹打至液体黏稠，4℃ 1 000 r/min离心5 min，收集上清。BCA法测定蛋白浓度，调整浓度至10 μl，－20℃保存。

1.2.4 CAV1 mRNA表达水平的荧光实时定量PCR(QRTPCR)检测 引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列见表1。PCR反应条件为95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，循环数为40。扩增体系为Takara SYBR Premix Ex Taq 10 μl，上下游引物各 0.4 μl，cDNA 模板2 μl，加水至总体积为 20 μl。采用用△△Ct方法，以看家基因β-actin mRNA作为对照，通过Ct值进行数据分析。因在细胞中扩增曲线良好，呈明显“S”型，反应体系扩增率正常。引物溶解曲线峰型单一，引物特异性良好，PCR产物单一。与WBC对照细胞(0.781±0.16)相比，SUP-B15(0.311±0.07)、HL-60(0.097 ± 0.02)、K562(0.127 ± 0.04)、THP-1(0.101±0.02)、CLL细胞(0.100±0.02)CAVI mRNA表达均降低。

2.3 CAV1蛋白表达水平的Western印迹检测结果 与对照组相比，在选取的五种白血病细胞中CAV1蛋白表达量均降低，且表达量由低到高依次为 CLL、HL-60、THP-1、K562、SUPB15。见图2。

表1 引物序列

1.2.5 CAV1蛋白表达水平的Western印迹检测 将蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰酶(SDS-PAGE)凝胶电泳，转膜，常温封闭2 h Tris盐酸缓冲液(TBST)冲洗2遍，加入CAV1 一抗(1∶500)或 β-actin一抗(1∶800)4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，10 min/次，加入二抗抗兔(1∶4 000)或抗鼠(1∶6 000)孵育，洗膜、发光、曝光、显影、定影，采用灰度扫描软件TotallLab进行胶片灰度扫描，分析检测结果。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行分析，数据资料采用t检验或单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果

2.1 总RNA浓度及纯度检测结果 紫外分光光度计结果显示A260/280在1.8～2.0之间，总RNA无明显基因组DNA污染，无明显降解。100 V恒压下1%琼脂糖凝胶电泳20 min，电泳结果显示，28 S和18 S rRNA两条带较为清晰，RNA纯度较高，无明显降解。见图1。

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳

2.2 CAV1 mRNA表达水平的QRT-PCR检测结果 CAV1基

图2 Western印迹检测CAV1蛋白表达水平

3 讨论

CAV1在肿瘤中的生物学作用是复杂的，可影响肿瘤的多药耐药〔4～6〕;调节细胞周期〔7〕与信号转导;参与调控衰老过程〔8，9〕;可增强细胞自噬功能〔10，11〕;参与细胞增殖、转移等。CAV1基因在肿瘤中的作用存在着争议，抑癌基因还是癌基因不可一概而论，在不同的肿瘤细胞中充当着不同的角色。在白血病细胞中，CVA1因类型不同表达亦不相同。有研究显示HTLV-1感染的T细胞株与未感染的T细胞株和正常的外周血单个核细胞相比，这些细胞表现出了CAV1的高表达〔12〕。急性白血病患者中初治时CVA-1蛋白表达水平明显低于正常对照组，诱导化疗缓解后表达水平有所上升，复发时表达水平再次下降，且可作为疗效判断指标〔13〕。国内外对CAV1基因与白血病发生机制的研究报道尚且不多，本课题为深入研究CAV1在白血病中的作用提供了必要的前提，具有重要的意义。

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