β2糖蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备与鉴定①

胥 亚 许国莹 周 红 解鸿翔 夏龙飞 刘敬敬 张晓蕾

(江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江212013)

抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome，APS)为一种非器官特异性自身免疫性疾病，主要临床表现为复发性动、静脉血栓及习惯性流产［1］。APS患者血清中高滴度的抗磷脂抗体(Antiphospholipid antibody，APL)与其血栓形成密切相关。研究表明，β2糖蛋白Ⅰ(beta-2-glycoprotein I，β2GPⅠ)是APL的关键靶抗原，其与相应抗体(anti-β2GPⅠ)形成复合物，在 APS病理过程中发挥重要作用［2，3］。β2GPⅠ是分子量约45～50 kD 的糖蛋白［4］，在血浆中浓度为 200 μg/ml左右，即 3 μmol/L，其结构由 5个补体调控蛋白样结构区(I～V)组成，肝脏是主要合成部位［5］。最初发现循环中的β2GPⅠ的一部分与脂蛋白相关，因此，β2GPⅠ也称作载脂蛋白H(apoH)。但是，目前的研究发现载脂蛋白H是个错误名称，β2GPⅠ与脂蛋白片段无关［6］。

近年来，β2GPⅠ及其抗体(anti-β2GPⅠ)在 APS病理机制中的作用受到极大关注。然而，β2GPⅠ /anti-β2GPⅠ促血栓形成的具体机制还未完全阐明。本研究从人血清中纯化出β2GPⅠ并制备了anti-β2GPⅠ多克隆抗体［7，8］。鉴于单克隆抗体具有特异性强，灵敏度高和易标准化等优点，本实验重点制备单克隆抗体并分析其特性，为深入APS病理机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 主要材料及试剂 人血浆β2GPⅠ为本实验室制备，已鉴定其与标准 β2GPⅠ特性相同［7，8］;antiβ2GPⅠ单克隆抗体(MAB1066)购自美国Chemicon公司;SP2/0细胞，HGPRT缺乏的骨髓瘤细胞系，由本室保存;BALB/c小鼠，6～8周龄，雌性，体重18～22克，用以提供免疫脾细胞和制备腹水单抗，购自扬州大学比较医学中心;RPMI1640培养基、胎牛血清、HT(次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸)液和HAT(氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸)购自Gibco公司;福氏完全佐剂与不完全佐剂、PEG1450、L-谷氨酰胺(L-G)、8-氮杂鸟嘌呤、Ig亚类鉴定试剂盒、牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司;羊抗鼠 IgGHRP购自武汉博士德生物工程有限公司;96孔、24孔培养板及酶标板购自Greiner公司;550型酶标仪购自美国Bio-Rad公司;倒置显微镜购自Olympus公司;其他化学试剂均为国产分析纯;其它ELISA相关试剂由本室提供。

1．2 方法

1．2．1 小鼠免疫 将人血浆β2GPⅠ用生理盐水稀释后与等量福氏完全佐剂充分乳化后制成免疫原，颈背部皮下多点注射6周龄BALB/c雌性小鼠(50 μg/只)。以后每隔2周用福氏不完全佐剂与同等剂量β2GPⅠ乳化后进行加强免疫2～3次(50 μg/只，腹腔注射)。末次加强免疫后7天，小鼠断尾取血，测免疫效价，选择免疫效价高的小鼠于末次加强免疫20天，用生理盐水稀释同等剂量β2GPⅠ进行尾静脉加强(12．5 μg/只)，冲击免疫后3 ～5 天内眼球采血留样，ELISA法测定免疫小鼠血清效价;取脾细胞用于融合［9］。

1．2．2 细胞融合和杂交瘤细胞的克隆化 SP2/0细胞于融合前扩大培养，挑选对数生长期的细胞用于融合。小鼠摘眼球取血，留血清作阳性对照，小鼠处死后取脾细胞，将脾细胞与SP2/0细胞以4∶1混合于融合管，离心，去上清，沉淀于37℃水浴中滴加1 ml 50%PEG1450，60秒内均匀加完，立即于90秒内滴加30 ml无血清RPMI1640培养基终止反应，37℃水浴中静置10分钟，离心去上清，融合细胞用HAT培养基稀释后铺入加有饲养细胞的96孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，3天后开始观察克隆生长情况，第4天用HAT培养基半量换液，7天左右用HT培养基完全换出孔中HAT培养基。采用间接ELISA法进行筛选，阳性孔转入24孔培养板扩大培养冻存，同时用有限稀释法进行3～4次亚克隆，至阳性率达100%扩大培养，建株保存［10］。

1．2．3 间接 ELISA 法检测 anti-β2GPⅠ抗体 β2GPⅠ用0．05 mol/L pH9．6的碳酸盐溶液稀释后包被酶标板，封闭液为含10%小牛血清的0．02 mol/L pH7．4 PBS。以正常鼠血清1∶1 000作为阴性对照，以β2GPⅠ免疫鼠的多抗血清1∶2 000作为阳性对照，用方阵滴定法确定包被抗原和酶标记抗体(羊抗鼠IgG-HRP)的最佳组合。结果判定:样品吸光度(A)值大于阴性对照A值的2．1倍判为阳性。

1．2．4 单克隆抗体的制备及纯化 取10～12周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡(0．5 ml/只)，7～10天后腹腔注射杂交瘤细胞［(0．5～1)×106/只］，7～14天左右抽取腹水，分装后贮存于－70℃冰箱。采用硫酸铵沉淀及 Protein G纯化腹水，以 SDSPAGE鉴定纯度。按经验公式:蛋白浓度(mg/ml)=1．45×A280-0．74×A260，计算纯化前后的蛋白浓度和收获率。SDS-PAGE按常规方法操作，12%分离胶，5%浓缩胶，抗体浓度1 mg/ml，与等量的还原型加样缓冲液混合，100℃ 5分钟，25 μl/孔上样，恒定电流50 mA电泳，0．25%考马斯亮蓝染色，进行蛋白扫描。

1．2．5 单克隆抗体的鉴定 用秋水仙素阻抑法获得较多的分裂中期的杂交瘤细胞，再经低渗，固定处理后，用10%Giemsa染液染色，镜下观察染色体;用间接ELISA法测定腹水效价;用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定Ig亚类(按说明书操作);用Western blot鉴定MAbs的特异性:用加样缓冲液将β2GPⅠ配制成1 mg/ml，12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，再以350 mA恒流转印至PVDF膜;膜置于含有5%脱脂牛奶的 TBS/T室温封闭1小时;将膜分别与1∶1 000稀释的各株β2GPⅠ单抗及标准β2GPⅠ单抗反应，次日用 TBS/T洗涤3次，15 min/次，采用HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶2 000)，37℃孵育1小时，TBS/T洗涤3次，15 min/次，ECL显色系统定影显色，观察杂交条带。

1．2．6 杂交瘤细胞株的鉴定 复苏液氮罐中冻存6个月的细胞株，经扩大培养后将细胞通过腹腔注射BALB/c小鼠，收集腹水测其对β2GPⅠ的ELISA滴度，观察杂交瘤细胞分泌anti-β2GPⅠ单抗的稳定性;染色体检查按常规方法进行。

2 结果

2．1 anti-β2GPⅠ单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立一共免疫两批小鼠，每批5只，于末次加强免疫后7天断尾取血，ELISA检测小鼠免疫效价，发现第2批5号小鼠免疫效果最好，免疫效价为1．0×104。经细胞融合、筛选和反复克隆化，最终获得1株稳定传代、分泌anti-β2GPⅠ抗体的杂交瘤细胞株，命名为:β2。细胞在体外连续培养3个月后，其培养上清效价没有变化，表明这细胞已成为稳定的杂交瘤细胞系。

2．2 间接 ELISA检测anti-β2GPⅠ抗体 最佳条件为:1 μg/ml β2GPⅠ包被酶标板，羊抗鼠 IgG-HRP工作浓度 1∶10 000。

2．3 腹水单抗制备及抗体纯化结果 杂交瘤细胞注射BALB/c小鼠，注射4只，共收集腹水约20 ml，所得腹水用硫酸铵法及 Protein G纯化后，SDSPAGE分析结果见图1，泳道为还原条件下电泳结果，分别为免疫球蛋白重链(约50 kD)和轻链(约25 kD)，腹水单抗的纯度在90%以上。

图1 纯化MAbs β2的12%SDS-PAGE分析Fig．1 SDS-PAGE analysis of purified MAbs β2

图2 杂交瘤细胞染色体分析Fig．2 Analysis of hybridism's chromosome

2．4 单克隆抗体鉴定 染色体鉴定结果显示，杂交瘤细胞染色体数目多于SP2/0细胞的51条，在99～108条之间(图2)。间接ELISA法结果显示杂交瘤细胞培养上清和纯化后的腹水单抗对β2GPⅠ的滴度分别为1∶29和1∶215。对MAbs的类及型别进行测定，结果显示细胞分泌 IgG1/κ型抗体(图3)。Western blot法进一步分析了杂交瘤细胞分泌的单抗对β2GPⅠ的反应性，以购置的标准β2GPⅠ单抗作为阳性对照，结果见图4。图4A为本次制备anti-β2GPⅠ单抗反应结果，结果显示单抗与PVDF膜上约45 kD的β2GPⅠ抗原发生反应，与67 kD处的BSA无明显反应，说明单抗只识别β2GPⅠ，特异性好，图4B为标准 anti-β2GPⅠ单抗反应(阳性对照)。

2．5 杂交瘤细胞的鉴定 杂交瘤细胞体外连续培养3个月后注射小鼠腹腔，采集腹水以间接ELISA法测其效价，效价保持稳定。冻存于液氮罐半年以上的杂交瘤细胞，经复苏扩大培养后注射小鼠腹腔，采取腹水用间接ELISA法测其效价，效价保持稳定。

图3 MAbs的亚类鉴定(试纸条法)Fig．3 Isotypes of MAbs to β2GPⅠ

图4 anti-β2GPⅠ单抗特异性分析(Western blot)Fig．4 Western blot analysis of MAbs to β2GPⅠ

3 讨论

本研究用本室制备的β2GPⅠ成功建立了分泌anti-β2GPⅠMAbs的杂交瘤细胞株，其染色体数为99～108条之间，为小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞之和。其分泌的MAbs亚类为IgG1/κ，专一性地针对β2GPⅠ分子的抗原决定簇，具有较高的特异性。应用该技术制备的单抗与多抗相比，具有纯度高、专一性强、重复性好、能持续的无限量供应等优点。目前anti-β2GPⅠ抗体市场上虽有国外供应，但本实验室用量大，成本高，因此自制anti-β2GPⅠ单抗对本实验室研究抗磷脂综合征具有重要的现实意义。研究表明，anti-β2GPⅠ抗体识别β2GPⅠ的I区与血栓形成相关［11，12］。Agar 等［13］发现存在两种形式的 β2GPⅠ:循环血浆形式和激活开环形式，当改变pH及盐浓度时，循环血浆形式变成开环形式，I区暴露，更有利于anti-β2GPⅠ抗体识别β2GPⅠ。为了更好地应用anti-β2GPⅠ单抗，还有必要进一步分析该抗体识别的抗原表位。β2GPⅠ单克隆抗体可广泛应用于基础医学研究，临床疾病诊断等方面，该抗体的制备对于基础及临床研究均具有重要意义。

1 Miyakis S，Lockshin M D，Atsumi T et al．International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome(APS)［J］．J Thromb Haemost，2006;4(2):295-306．

2 Bas de Laat H，Derksen R H，de Groot P G．beta2-glycoprotein I，the playmaker of the antiphospholipid syndrome［J］．Clin Immuno，2004;112(2):161-168．

3 严一红，周 红，周保成 et al．TLR4在anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用探讨［J］．中国免疫学杂志，2010;26(5):396-401．

4 Lozier J，Takahashi N，Putnam F W．Complete amino acid sequence of human plasma beta 2-glycoprotein I［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1984;81(12):3640-3644．

5 Ragusa M A，Costa S，Cefalù A B et al．RT-PCR and in situ hybridization analysis of apolipoprotein H expression in rat normal tissues［J］．Int J Mol Med，2006;18(3):449-455．

6 Aĝar C，de Groot P G，Levels J H et al．Beta2-glycoprotein I is incorrectly named apolipoprotein H［J］．J Thromb Haemost，2009;7(1):235-236．

7 黄宏亮，周 红，王 婷 et al．β2糖蛋白Ⅰ纯化及其稳定性分析［J］．江苏大学学报，2008;18(4):344-347．

8 黄宏亮，周 红，俞 颖et al．兔抗人β2糖蛋白Ⅰ多克隆抗体的制备与鉴定［J］．临床检验杂志，2009;27(3):192-194．

9 Köhler G，Milstein C．Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity［J］．Nature，1975;256(5517):495-497．

10 Zeng K，Yang T，Zhong P et al．Development and identification of monoclonal antibodies against parathion［J］．Hybridoma(Larchmt)，2005;24(6):298-304．

11 de Laat B，Derksen R H，van Lummel M et al．Pathogenic anti-beta2-glycoprotein I antibodies recognize domain I of beta2-glycoprotein I only after a conformational change［J］．Blood，2006;107(5):1916-1924．

12 Ioannou Y，Romay-Penabad Z，Pericleous C et al．In vivo inhibition of antiphospholipid antibody-induced pathogenicity utilizing the antigenic target peptide domain I of beta2-glycoprotein I:proof of concept［J］．J Thromb Haemost，2009;7(5):833-842．

13 Agar C，van Os G M，Mörgelin M et al．Beta2-glycoprotein I can exist in 2 conformations:implications for our understanding of the antiphospholipid syndrome ［J］．Blood，2010;116(8):1336-1343．