辅助性T细胞亚群的多样性与分化的可塑性研究①

周 琳 周光炎 路丽明

(上海交通大学医学院上海市免疫学研究所，上海200025)

通过选择性表达和分泌专一的转录因子和细胞因子，CD4+Th细胞分为不同的亚群，分别行使不同的免疫生物学功能。不同的CD4+Th细胞亚群对于维持宿主的防御功能和机体正常的免疫调节有重要作用。

受细胞内外多种因素影响以及表观遗传机制的修饰与调控，细胞亚群具有相对稳定的表型［1］。比如，CD4+T细胞最初主要分成两种亚群:表达T-bet和 IFN-γ 的 Th1，和表达 Gata3和IL-4的Th2［2］。这为我们理解T细胞特性和其发育的基因调控提供了一个简单的模型。但Th1/Th2分类不能很好地解释免疫与自身免疫中的许多问题，而且研究发现，极化的Th1和Th2细胞亚群在细胞因子IL-4、IFN-γ的作用下可以发生相互转化，Gata3+Th2细胞在病毒感染的情况下可以重编程，表达T-bet并分泌IFN-γ。随着研究的不断深入，新近鉴定的CD4辅助性 T细胞亚群，已包括 Th9、Treg、Th17、Th22和Tfh，相关进展将有助于更好地理解正常和病理状态下的免疫应答及其调控机制。

Th9亚群是一类主要分泌 IL-9和 IL-10的CD4+T细胞。在体外，Th9可由初始CD4+T细胞在IL-4和TGF-β共同诱导产生，也可单独在TGF-β作用下由Th2细胞亚群分化而来。其专一的转录因子尚未明确，但干扰素调节因子IRF4和PU.1在Th9细胞亚群分化中起了重要作用。Th9细胞亚群在抗寄生虫及变应性炎症中十分活跃，与过敏性哮喘、炎性肠道疾病以及众多自身免疫疾病密切相关［3］。体外研究发现Th9细胞亚群并不稳定，由鸡卵溶菌酶(HEL)诱发的Th9细胞能够在一系列的极化培养基中向 Th1、Th2、Th17 细胞转化［4］，初始 T细胞分化成Th9细胞亚群需要IL-4和TGF-β的共同作用，若缺乏IL-4，初始T细胞在TGF-β的诱导下会向Treg细胞亚群分化［5］。

调节性T细胞(Treg)是CD4+T细胞谱系中的重要组成部分，参与维持机体的免疫稳态。主要分为胸腺来源的自然调节性T细胞(nTreg)和外周诱导的适应性调节T细胞(iTreg)。转录因子Foxp3表达于Treg细胞中，而其一直被认为是Treg专一转录因子，近期，Cretney［6］报道，Blimp-1和IRF4也能够促进Treg细胞获得免疫抑制能力，Beyer等［7］认为Treg在SATB1的诱导下能重新分化为效应T细胞，另外，Treg细胞能够不表达Foxp3，却能分泌促炎细胞因子，而最近发现的滤泡调节T细胞(Follicular regulatory T)可能来源于 Foxp3+前体细胞［8］。由此看出Treg也并非终末细胞，其具有一定的可塑性。Treg细胞的鉴定是一项重大发现，已知包括癌症、自身免疫病、移植排斥在内的众多疾病均与Treg细胞密切相关。

Th17细胞亚群能选择性表达IL-17和特征性转录因子RORγt，主要作用于炎症细胞，参与炎症反应。Th17细胞的异常与自身免疫性疾病、感染性疾病以及癌症等疾病密切相关［9］。对Th17细胞的认识使我们更深入地了解了辅助性T细胞的分化特点和自身免疫性疾病的发生机制。Th17细胞具有一定的可塑性，可以向分泌IFN-γ的Th1细胞亚群转化［10］，同时，已完成分化的Th17细胞亚群在缺乏TGF-β维持的情况下，会同时表达转录因子RORγt和T-bet。

Th22细胞亚群主要分泌IL-22、IL-26和IL-13，其表型为CCR6+CCR4+CCR10+，特征性转录因子主要是芳香烃受体(AHR)。它能帮助机体通过炎症对抗感染，且与风湿性关节炎、牛皮癣和克罗恩病等自身免疫性疾病发病密切相关［11］。

滤泡辅助性T细胞(Tfh)是最新鉴定的CD4+T细胞亚群，它是一群位于外周淋巴组织生发中心的T细胞。Tfh表达特征性转录因子Bcl-6、细胞因子IL-21以及特征性的表面分子PD-1、CXCR5和ICOS等［12］。Tfh细胞亚群能够促进B细胞的类别转换和体细胞高频突变，其功能失调会导致系统性红斑狼疮和其他自身免疫性疾病的发生。Tfh细胞可能是最具可塑性的细胞亚群，Tfh在体外能够转化成Th1、Th2和 Th17，相反地，Th1、Th2和 Th17细胞亚群也可以获得Tfh细胞的特性［13］。体内分离出的Tfh细胞也可以表达其他辅助性T细胞的特征性细胞因子。在派尔集合淋巴结中，Foxp3+T细胞可以转换成为Tfh细胞［14］。因此，是否应该把Tfh细胞和其他辅助性T细胞一样归为一类特定细胞谱系还存在争论。或许它仅仅是Th1、Th2、Th17和Treg细胞分化过程的一个阶段。另外虽然IL-21主要由Tfh细胞分泌，但是Th17和Th1等细胞也可以分泌 IL-21［15］。

如果辅助性T细胞亚群具有多样性与分化的可塑性，那么决定其表型分化可塑性的影响因素和调控机制是什么呢?

目前提出主要有以下因素:(1)多种转录因子的作用;(2)细胞分化过程中表观遗传学格局的改变;(3)微小RNAs(microRNAs)的调控作用。

1 辅助性T细胞可以表达多种关键转录因子

定义一个细胞亚群的基本标准包括细胞的不同表型以及专一的、特征性转录因子。然而，越来越多的研究表明CD4+T细胞能表达多种关键转录因子。例如，FoxP3+细胞可以表达与其功能密切相关的转录因子 T-bet、Gata3、RORγt、STAT3 和 Bcl6。某些Treg细胞对IFN-γ产生应答，表达转录因子T-bet，从而促使CXCR3的表达，有利于Treg细胞迁移至Th1细胞亚群相关的炎症部位［16］。Gata3是Th2细胞亚群的关键转录因子，但在胃肠道和皮肤中的Treg细胞也可以表达Gata3，同时TCR和IL-2的刺激也可以诱导Gata3在Treg细胞表达。尽管Gata3对于维持Treg细胞的功能和内稳态不是必需的，但它可以维持FoxP3的表达，防止Treg细胞转变成效应T细胞［17］。许多 CD4+T细胞共表达 FoxP3和RORγt，这些 T细胞表达 CCR6，激活后分泌 IL-17，同时也具有抑制活性［18］。STAT3是促使 Th17和Tfh细胞分化的一种重要转录因子，将Treg细胞中的STAT3基因敲除后同样会导致自身免疫反应［19］。最后，位于生发中心、表达 Bcl6的 Treg细胞，有抑制B细胞免疫应答的功能［8］。以上研究表明，对效应细胞谱系有重要作用的某些转录因子复合物能被Treg细胞所用，从而对效应细胞发挥特异的抑制作用。以此来看，Treg细胞可以看作是一群异质性的动态细胞群体。

同样，炎症性 Th17细胞亚群可以同时表达RORγt和 T-bet或 Gata3。在 EAE模型中，T-bet+RORγt+T细胞是具有高致病性的，T-bet+T细胞的表达是致病的重要原因，即便IFN-γ并不参与［20］。

在寄生虫感染的情况下，Gata3可以和Bcl6共表达［21］。事实上，CD4+T细胞普遍表达 Bcl6，而不仅仅局限于Tfh细胞。IL-6和IL-21通过STAT3途径促进Tfh细胞亚群增殖，但Tfh细胞在缺乏这些因子的情况下也可以分化。这是因为IL-12通过STAT4信号途径能够促进IL-21和Bcl6的分泌与表达［22］。早期Th1细胞亚群可以同时表达Bcl6和T-bet。所以，这些因子不仅相互拮抗各自的功能，还能共同抑制相关基因表达。

相反地，即使一种特征性转录因子对于某种细胞亚群的分化是必需的，但仅仅有它仍是不够的。正常Treg细胞分化需要Foxp3，但Foxp3的表达不足以诱导完整的Treg细胞亚群的表型，而且即使没有Foxp3，某些 Treg细胞仍具有相关功能［23］。同样，没有T-bet也不能停止Th1细胞亚群的分化［24］。

由此可以看出:在辅助性T细胞中，表型和关键转录因子的表达并不是简单的一对一关系。主要转录因子的作用与经典细胞生物学中描述的功能相去甚远，它们既不是绝对必要，也不是唯一的，况且同时表达多种关键转录因子是时常发生的。因此，不能简单地认为终末分化的细胞只表达专一的转录因子，事实上多种关键转录因子共表达的提法才更准确。这些因子能受内外界的因素动态调控，根据环境需要改变T细胞的功能。

2 细胞分化过程中表观遗传学参数的改变

完全分化的细胞经过多次细胞分裂趋向于表达固定的细胞表型，不会继续存在诱导其分化的信号。不同的细胞表型不仅仅是转录因子调控表达的结果，也可能是由基因调控的核染色质结构变化所引起。

组蛋白N末端可以通过乙酰化、甲基化和磷酸化作用被共价修饰。组蛋白修饰与基因表达密切相关，通过改变核染色质的结构可以激活或抑制基因转录［25］。例如，组蛋白 H3赖氨酸 4三甲基化(H3K4me3)与基因活化密切相关［26］。相反，polycomb蛋白复合体可以催化组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)，抑制基因表达。

在辅助性T细胞分化为相应的细胞谱系过程中，其特征性细胞因子基因会显示活化标志(H3K4me3)，而在其他细胞谱系中显示抑制信号(H3K27me3)。比如 Th1细胞亚群的 Ifnγ基因和Th2细胞亚群的IL4基因的甲基化状态的作用相反。Th17细胞亚群与它们相比却有相当大的内在不稳定性。当Th17细胞亚群受IL-2刺激时，其Ifng基因座位迅速发生染色质重塑，Th17细胞亚群的不稳定性与之密切相关［27］。

更重要的是，组蛋白甲基化对编码这些关键转录因子基因的调控并不是简单的激活或抑制。即使转录因子不表达，也可以同时显示出抑制和活化的表观遗传标志。例如，在Th1细胞亚群中，活化信号H3K4me3与 Tbx21基因是密切相关的［28］。尽管Th2和Th17亚群中存在抑制性标志H3K27me3，但也同时存在活化信号H3K4me3［29］。这些同时被两种核染色质修饰所标记的区域被称为二价结构域(bivalent domains)。T-bet基因座位的这种静止的状态可以解释在Treg、Th17和Th2细胞亚群中T-bet是怎样被诱导的。同样，在极化的Th1、Th2和Th17细胞亚群中Bcl6基因座位存在活化信号H3K4me3标志，而 Tfh细胞亚群中 Tbx21、Rorc和Gata3基因也有激活标志［15］。这说明在已经定型的细胞如Th1、Th2和Th17细胞亚群中转录因子能被很容易地诱导，这为支持Tfh细胞亚群的可塑性提供了证据。应当指出的是:二价结构域的出现是细胞亚群异质性的一种反映，但细胞因子基因的转录激活并没有如此复杂的现象。

3 微小RNA调控CD4+Th细胞的分化和表型维持

微小RNA(miRNA，miR)是约为22个核苷酸的非编码小RNA，能与靶mRNA结合，抑制其翻译或导致其降解。Drosha和Dicer是miRNA产生的两种关键酶。它们的缺失与自身免疫病的发生和Treg细胞亚群的不稳定性密切相关［30］。在人和鼠的各种辅助性T细胞中发现了不同miRNA的表达，这说明每种miRNA对于某些细胞亚群可能有独特的作用。更多的研究揭示了miRNA调控辅助性细胞的分化和表型维持。

研究已发现miR-125b有助于维持辅助性T细胞的初始状态［31］，而miR-182则可以促进活化辅助性T细胞克隆扩增［32］。miR-29通过 T-bet、Eomesodermin和 IFN-γ 调节 Th1细胞亚群的分化［33］;miR-155则会影响Th1、Th2亚群的分化和Treg细胞亚群的 发 育 成 熟［34，35］;miR-326 通 过 Ets-1 促 进Th17细胞亚群的分化［36］;miR-146a对 Treg细胞的抑制功能是非常重要的［37］。另一方面，Bcl6也能抑制多种miRNA的表达，包括能抑制与CXCR5表达相关性miR-17-92的表达，以此调控Tfh细胞的表面标记［38］。对miRNA调控CD4+Th细胞的分化和表型维持的研究将有助于我们更准确地了解决定CD4+细胞表型稳定性的因素，甚至可能会改变我们对重要转录因子相互作用的认识，但相关证据仍不充分，需进一步研究。

4 结论

CD4+辅助性T细胞能够分化成多种稳定的细胞亚群，但也存在一些分子机制使该分化过程具有相当的可塑性。组蛋白表观遗传学分析也表明:同一细胞亚群中同时存在着相对稳定的终末分化以及可塑性两种可能。而最近的研究表明，多种miRNA参与调控CD4+T细胞表型的稳定性。因而对生物体而言，CD4+T细胞亚群分化的可塑性，有利于宿主产生有效的免疫应答机制。因而深入了解调控CD4+T细胞稳定性和可塑性的内外信号通路，将有助于开发出有效的治疗方法来控制自身免疫性疾病和其他免疫相关疾病。

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