BubR1 基因表达对肝癌细胞对紫杉醇的敏感性的影响

刘 斌,刘 婧，刘卓然

(南华大学附属第二医院，湖南 衡阳，421001)

紫杉醇(paclitaxe1)是一种作用较强的化疗制剂，可与纺锤体微管结合，抑制微管的组装，从而导致有丝分裂阻滞及细胞死亡。目前常用于乳腺癌和卵巢癌等实体瘤的治疗，但是其作用常因药物耐受的形成而受到限制。故对紫杉醇耐药原因进行探讨及提高其敏感性是当今医疗界亟待解决的问题之一[1]。探求影响细胞分裂的蛋白质与紫杉醇之间的关系，可能对研究其耐药机制有着重要的意义。BubR1 是一种作用于细胞有丝分裂期的驱动蛋白，连接染色体与纺锤体微管，在细胞分裂过程中具有重要的作用。另外BubR1 在大部分肿瘤组织中相对于癌旁组织都表现为过表达[2]。因此推测BubR1很可能与紫杉醇对肿瘤细胞的疗效有一定的影响。本实验通过构建带有针对BubR1 基因的特异性短发夹RNA(short hair RNA，shRNA)的载体，转染肝癌细胞后评价其干扰效果，通过MTY 法观察BUBR1表达下调后肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性，探讨BubR1 与紫杉醇抗肿瘤治疗之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

质粒抽提试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司。BubR1和GAPDH的 一抗，二抗购自Santa-Cruz 公司。SYBR Green 染料荧光定量试剂购自Takara 公司。RIPA 裂解液购自上海申能博彩。

1.2 标准质粒的构建

1.2.1 RNA的提取和逆转录

将处理前后的HepG-2 细胞，按照试剂盒说明书操作用Trizol 试剂(GIBICO 公司)提取总RNA。然后按照Takara 公司逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA 保存备用。

1.2.2 PCR 反应及产物鉴定

引物序列由Takara 公司设计并合成,BubR1 基因上游引物：5′-GCTGTCTGCGATACTGTGAAC-3′；下游引物：5′-CAATCCCTCCAAAATCAAGTG-3′。内参GAPDH 上游引物：5′-GCAGAGGGGGCAGAGATGA-3′，下游引物 ：5′ -ACTCCTCTGGCTTCTCTGGTT0-3′ 。PCR 反应条件为：94 ℃5 min 1 个循环；94 ℃15 s，63 ℃15 s，72 ℃15 s 35个循环；72 ℃10 min 1 个循环；4℃保存。

1.2.3 T-A 克隆

将PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳,按照华舜胶回收试剂盒说明书纯化PCR 产物,按照Takara 操作说明书将其连接到pMD18-T 质粒上，转入DH5a 感受态细菌中，铺板挑阳性菌落做菌落PCR，初步鉴定为阳性者增菌提质粒送公司测序，经DNAssist Versuib 1.02 软件比对后制备纯化质粒。

1.3 荧光定量PCR

用SYBR Green 染料荧光定量法(Takara 公司的试剂)检测BubR1 基因的mRNA的水平，BubR1基因与内参引物见前。用已稀释的标准质粒作为阳性标准品。扩增条件为：95 ℃10 s，一个循环；95℃5 s，63 ℃31 s，40 个循环；

1.4 shRNA 设计及质粒的构建

正义链5'-GATCCCGcACCGATGCTGGTGACCTCCAACAGAGAGCTCACCACCA-3'，反义链5-AGCTYAAAAAAGCACGCATGCTGGTGACCTCTCTCTFGAAGAGG TCACCAGCATCCGTGCGG-3'。用BLAST 软件进行同源性分析证实为靶基因高度保守区段后，送上海Invitrogen 公司采用化学合成方法合成单链寡核苷酸；退火形成双链DNA，插入线性载体pGenesil.1 质粒中；转化至感受态大肠埃希菌DH5a 后，挑选单克隆，经扩增，抽提质粒，双酶切鉴定和DNA 测序分析。

1.5 转染质粒DNA 及实验分组

转染的前一天将HepG-2 细胞传代到24 孔板内，细胞密度为1×105～2×105/孔，培养12 h 以上，当细胞密度达80%左右时即可进行转染。将细胞分为实验组：pshRNA-Cenp-E-1+lipofectamine2000；对照组：pgenesil-1+lipofectamine2000；空白组：ddH2O+lipofectamine2000。

1.6 Western blot 免疫印迹

Western blot 检测BubR1蛋白的表 达。将HepG-2 细胞提出的蛋白经10%十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至PVDF 膜.用相应抗体进行免疫印迹分析。

2 结果

2.1 BubR1 基因mRNA 水平分析

荧光定量PCR 检测BubR1 基因在各组的mRNA 水 平，以BubR1 基 因mRNA 拷 贝 数/GAPDH 基因mRNA 拷贝数的均值作为该样品中BubR1 基因表达水平，结果显示干扰前后两种细胞中BubR1 基因mRNA 水平用成组t 检验P＜0.05,差异有统计学意义(表1)。

表1 干扰前后HepG-2 细胞BubR1 基因的荧光定量PCR结果(Mean±SD)

2.3 Western blot 结果

通过灰度扫描，可以发现BubR1 蛋白表达量(与内参蛋白GAPDH的灰度值比值)在干扰前中为0.356±0.012，在干扰后中为0.016±0.009。用成组t检验P＜0.05,差异有统计学意义(n=21)(图2)。

图2 干扰前后HepG-2 细胞western blot 结果

2.3 各组细胞的增殖抑制

根据MTT 分析结果计算细胞的抑制率,如图3,4用不同浓度的紫杉醇处理3组细胞24 h和48 h 时均发现，BubR1 干扰实验组细胞的增殖抑制率与未转染空白对照组和空载对照组比较，均有明显增加(P＜0.05)，且在1～100 nmol/L 之间呈现剂量依赖性，以100 nmoL/L 紫杉醇作用最为明显；而药物浓度再增高时各组细胞的增殖抑制率没有出现明显的变化(P＞0.05)。

图3 紫杉醇处理24 h 细胞增殖抑制率

图4 紫杉醇处理48 h 细胞增殖抑制率

3 讨论

BubR1 是特异性作用于细胞有丝分裂过程中的一个重要基因，在染色体运动及中板集合时都起着重要作用，其可能是有丝分裂检查点信号途径的一个关键因子[3]。有研究提示，BubR1 很可能对作用于有丝分裂期的化疗药物紫杉醇的疗效存在一定影响[4]。本研究设计针对BubR1 基因的shRNA 序列，构建干扰载体，转染细胞后，检测BubR1 在mRNA和蛋白水平及内源性的表达。结果显示，shRNA-BubR1 具有明显的干扰效果，在mRNA和蛋白质水平均能有效抑制BubR1的表达。用不同浓度的紫杉醇处理后，MTT 结果显示各组细胞的增殖抑制率与药物浓度有明显的时间和剂量依赖性，干扰实验组的增殖抑制率在不同浓度下均明显大于空白对照组和空载对照组，其中尤以紫杉醇浓度为100 nmol/L、24 h 时各组之间的差异最大，更大剂量的紫杉醇作用时细胞增殖抑制率则没有明显增加。Wang 等发现紫杉醇有双相性的剂量反应，低浓度紫杉醇造成有丝分裂紊乱，细胞出现微核化，最终导致细胞死亡；而高浓度常常只促使细胞株的有丝分裂被长期抑制。以上结果显示，BubR1表达下调能增强HepG-2细胞对紫杉醇的敏感性。分析BubR1表达下调使细胞对紫杉醇敏感性增强的原因，可能有以下几个因素：(1)干扰CENP-E表达后，细胞阻滞在有线分裂中期的时间延长，有丝分裂进程延长，很可能增加紫杉醇作用的时间，从而提高紫杉醇作用的疗效[5-7]；(2)BubR1 本身就是一个潜在的抗癌药物的作用靶点，因此干扰BubR1表达与紫杉醇应用可能起协同作用[8-10]。综上所述，靶向BubR1 基因的shRNA 重组质粒能够部分下调宫颈癌细胞中BubR1的表达，提高细胞对紫杉醇药物的敏感性。推测靶向干扰BubR1表达可能是肿瘤治疗的一种策略。

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