荆芥水提物对马铃薯酪氨酸酶作用的研究

屈长青，张传开，林 莉，姚星星

1抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心;2阜阳师范学院生命科学学院，阜阳 236041

黑色素广泛存在于动物、植物和原生动物之中。人体中的黑色素主要聚集在皮肤之中，黑色素异常会导致雀斑、黄褐斑、黑变病和白发病等相关疾病。黑色素是在酪氨酸酶的参与下生成的，过程如下:

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一种广泛存在的与黑色素形成密切相关的含有 Cu2+的金属酶［1，2］。具有单酚酶和二酚酶的活性。酪氨酸酶的活性与黑色素合成量相关，控制其活力即可控制黑色素生成量［3］，因此，酪氨酸酶抑制剂如熊果苷和曲酸也被作为具有美白作用的添加剂加入到化妆品中［4］。近年来，含有中药有效活性成份的化妆品的开发日益受到国内外商家的重视，也深受消费者的青睐，具有很大的市场潜力［5］。

疏毛罗勒(Ocimum basiliam Linn var.ppilosum(wild.)Benth)，一年生草本植物，为唇形科植物，是一种药食两用植物，具有营养芳香、调味、保健等多种功能，可广泛应用于食用、食品工业、日用化工和医药保健等方面。有报道说，罗勒全草用药，有驱风、健胃和发汗等作用，可治疗肠胃病、风湿性关节炎等［6］。因罗勒的茎、叶富含芳香油，是重要的调香原料，所以对其挥发油的研究较多。如杨洪霞等分析发现，疏毛罗勒油的主要成分是萜烯及其含氧衍生物［8］。本实验研究罗勒多糖对酪氨酸酶的作用，在发掘罗勒最大利用价值的同时，也为试图找到一种新的美白替代产品提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

疏毛罗勒(Ocimum basiliam Linn var.ppilosum(wild.)Benth)购于阜阳市农贸市场，为当年4月份采摘，经阜阳师范学院生命科学学院董金廷教授鉴定，洗净晾干。新鲜马铃薯。

正丁醇、氯仿、95% 乙醇、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、维生素C(均为分析纯);L-酪氨酸购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

UV-2600A型紫外可见分光光度计;RE-2000旋转蒸发仪;TD25台式低速自动离心机;AR224CN电子天平;恒温水浴锅;Hema冷冻离心机。

2 试验方法

2.1 酪氨酸酶提取液的制备

参照任红荣等的方法［5］，称取去皮切碎马铃薯2 g(-20℃冷冻过夜)，按1∶5(m/V)的比例加入磷酸盐缓冲液(pH 6.8)10 mL，用力研磨挤压1 min，立即3000 rpm离心5 min，分离出上清液保存于4℃冰箱，备用。

2.2 罗勒多糖的制备

参照张晓莉等文献［9］，称取5 g罗勒，粉碎，加入200 mL双蒸水，在100℃温度条件下回流提取2 h。过滤，滤渣继续加入150 mL的双蒸水，继续回流提取1 h，合并两次提取液。旋转蒸发浓缩至100 mL，放置冷却，3000 rpm离心5 min，得上清液。然后将得到的上清液与体积比为4∶1的氯仿与正丁醇液混合，除去蛋白。再将去蛋白后的溶液与氯仿充分混合，以除去一些脂溶性的物质，最后再将脱脂后的溶液和95%的酒精混合配制成终浓度为80%的酒精多糖溶液，放于4℃冰箱中静置12 h，3000 rpm离心3 min得深棕色沉降物。用丙酮和无水乙醇分别洗涤沉降物2次，烘干至粉末状，常温保存备用。

2.3 酪氨酸酶抑制率的测定［11，12］

酪氨酸酶活力的测定反应总体积为3 mL，具体设计见表1。

在此体系中，罗勒多糖和维生素C浓度分别为2、3.5、5、6、7、7.5 和 8 g/L。向试管中依次加入PBS缓冲液、不同浓度罗勒多糖和维生素C溶液和酪氨酸酶提取液，于30℃水浴10 min，然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时，测定a、b、c和d管反应20 min时475 nm波长下的吸光值。测定时，以双蒸水为参比溶液。每组设3个平行。

表1 反应物质与体积Table 1 Reactive substances and volume

酪氨酸酶的抑制率按如下公式算出:

公式中，ODa、ODb、ODc与 ODd表示各管吸光度。ODa表示不加抑制剂时，酪氨酸酶反应体系的吸光度值;ODc表示加了罗勒多糖或维生素C以后，酪氨酸酶反应体系的吸光度值;ODb和ODd是没有添加L-酪氨酸时的吸光度值。根据实验得出的数据，分别作出罗勒多糖和维生素C对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用曲线，并依据浓度-酶抑制率曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。

2.4 数据分析

所有的数据均用Excel和SPSS11.5软件处理，各组间数据采用最小显著极差法(LSD法)。

3 试验结果

经分光光度计检测不同溶液吸光度，结果如图1所示:

图1 罗勒多糖和维生素C对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用Fig.1 Inhibition effects of polysaccharide of Ocimum basili am and vitamin C on the activity of potato tyrosinase

从上图可知，罗勒多糖和维生素C对马铃薯酪氨酸酶均有抑制作用;罗勒多糖在较低浓度时，其抑制作用要小于维生素C，浓度为7 g/L时，对酪氨酸酶的抑制作用与维生素C相当，之后，维生素C的抑制作用下降，而罗勒多糖抑制作用继续升高，当罗勒多糖浓度为7.5 g/L时抑制率达到82.6%，远远高于同浓度的维生素C;当多糖浓度为8 g/L时，抑制作用迅速下降，抑制率为47.8%。根据浓度-酶抑制率曲线算出罗勒多糖酪氨酸酶的半抑制物浓度IC50约为 4.7 g/L。

4 讨论

酪氨酸酶是皮肤黑色素生物合成的关键酶。近年来，随着化妆品行业的飞速发展，酪氨酸酶抑制剂的研究非常活跃，大量化学合成的抑制剂及植物来源的天然抑制剂得到开发应用，比如水杨酸类、壬二酸类、果酸、维生素C、曲酸或者由它们合成的衍生物等。“组份天然化”及“回归大自然”的呼声已成为化妆品工业的潮流，化妆品的原料天然化倍受重视［13］。

疏毛罗勒，一年生草本，高20～80 cm，其茎、叶富含芳香油，是重要的调香原料。维生素C是酪氨酸酶的非竞争性抑制剂，能够很好的抑制酪氨酸酶的活性，已经被作为酪氨酸酶的抑制剂添加到化妆品中。本实验以维生素C为阳性对照，从图中可以看出罗勒多糖和维生素C对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用趋势相似。两者的浓度在2 g/L到6 g/L的梯度范围内时，抑制曲线均呈现上升趋势，表明此浓度范围内对酪氨酸酶的抑制率逐渐增强。之后维生素C抑制曲线逐渐下降，表明对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用降低。而罗勒多糖的则在浓度为7.5 g/L时抑制率达到最高，最大抑制作用可以达到82.6%左右，远高于维生素C的最高抑制作用。实验结果表明，罗勒是一种非常有潜力的酪氨酸酶抑制产品。

本实验提取的罗勒多糖是粗多糖，其纯度需进一步提高，后续的研究将从优化多糖提取工艺和纯化方法上入手。在提取工艺上除采用本实验使用的水提醇沉法外，还可以用酸提取法，碱提取法，超声波提取法以及超临界流体萃取等［13］方法。在此基础上，用超滤法，柱层析法或者色谱法等纯化，研究其对酪氨酸酶的抑制作用，为开发罗勒美白作用提供理论依据。

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