超声波法提取胎菊中绿原酸的研究

刁全平，侯冬岩，回瑞华，赵元元

鞍山师范学院化学与生命科学学院，鞍山 114005

胎菊系菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序［1］，在花朵尚未完全张开时收摘所得，亦名小汤黄、小白菊，是浙江传统道地药材“浙八味”之一，亦可加工制成高端饮品。胎菊性微寒，味辛甘苦，对中枢神经有镇静作用，还具有解热和抑菌等作用［2］。绿原酸作为菊科植物中的主要药理成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、降糖等多种作用［3］。目前对胎菊中绿原酸的提取检测方法尚未见文献报道，本文尝试采用超声波法对胎菊中绿原酸的提取进行研究，对提取溶剂、提取时间、提取料液比等因素进行考查，确定胎菊中绿原酸的最佳提取条件，并建立HPLC法测定胎菊中绿原酸的方法，为胎菊的质量监控提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器:高效液相色谱仪(美国Waters公司，配有510泵，486可变波长紫外检测器);N3000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所);KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

试剂:HPLC所用的乙腈为色谱纯(天津市彪仕奇科技发展有限公司)，其他均为分析纯，水为二次蒸馏水。

胎菊购自杭州艺福茶业有限公司。

绿原酸对照品购自中国食品药品检定研究院。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm，大连化学物理研究所);流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液(10∶90);流速为1.0 mL/min;柱温为室温;检测波长为327 nm;进样量为10 μL。

1.2.2 供试液的制备

精确称取样品(约1.0 g)置于100 mL锥形瓶中，加入提取溶剂，塞紧塞子，置于超声波清洗器中，提取一定时间后，过滤，再用提取溶剂清洗2次，合并滤液并定容于100 mL容量瓶中，0.45 μm滤膜过滤后，HPLC测定其含量，并计算提取量。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 标准曲线的绘制

准确称取3.0 mg绿原酸对照品置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容。然后分别准确移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容。按照1.2.1的色谱条件进行测定，以峰面积(A)纵坐标，浓度(C)为横坐标作标准曲线得回归方程为A=32163C-41092，线性相关系数 r=0.9998，表明绿原酸在15 ～90 μg/mL范围内线形关系良好。

1.2.3.2 精密度实验

以甲醇为提取溶剂，料液比为1∶20，超声时间为80 min对样品进行提取，将提取液重复进样6次，测定其峰面积，计算提取量并计算 RSD =0.615%，说明实验精密度良好。

1.2.3.3 稳定性实验

取绿原酸对照品溶液，每隔2 h进样，测定其峰面积，计算RSD=0.344%，表明在12 h内基本稳定。

1.2.3.4 回收率实验

准确称取质量为0.5506 g的胎菊样品3份，分别加入标准样品 0.70、1.0、1.3 mg，以甲醇为溶剂，料液比为 1∶20，超声 80 min，按照步骤 1.2.2 进行处理，测得结果见表2。

表2 回收率实验Table 2 Recovery of chlorogenic acid

由表2可知，回收率在98.10% ～103.3%之间，平均回收率为100.3%，表明本方法准确。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

分别以甲醇、乙醇、丙酮、水为提取剂，按照1∶15的料液比，对样品超声80 min后，HPLC测定溶液中绿原酸的含量，结果见表3。

表3 提取溶剂对胎菊中绿原酸提取量的影响Table 3 Effect of extraction solvent on extraction amount of chlorogenic acid

由表3可见，采用甲醇作为提取溶剂，胎菊中绿原酸的提取量较高。

2.2 提取时间的选择

以甲醇为提取溶剂，按照1∶15的料液比，分别超声提取 20、40、60、80、100、120 min，结果见图 1。

图1 提取时间对胎菊中绿原酸提取量的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction amount of chlorogenic acid

由图1可知，提取时间为80 min时，胎菊中绿原酸的提取量最高。时间太短，提取不完全;时间太长，绿原酸不稳定，容易分解，导致提取量下降。所以本试验提取时间采用80 min。

2.3 提取料液比的选择

以甲醇为提取溶剂，提取时间为80 min，采用不同提取料液比，考查其对提取量的影响，结果如表4所示。

表4 提取料液比对胎菊中绿原酸提取量的影响Table 4 Effect of sample-solvent ratio on extraction amount of chlorogenic acid

由表4可见，当料液比为1∶20时，提取量较高，料液比为1∶25时变化不大，所以采用料液比为1∶20。

2.4 样品的测定

精确称取样品1.0000 g胎菊样品，按照最佳提取条件对其中的绿原酸进行提取，HPLC测定其含量为 1.878 mg/g。

图2 绿原酸对照品及胎菊HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of chlorogenic acid standard(A)and chrysanthemum bud sample(B)

3 结论

文献报道绿原酸可以采用索氏提取法［4］、热回流提取法［5，6］、超声波提取法［7］等进行提取，可绿原酸不稳定，遇光及热易分解，特别是长时间受光及加热。本文采用超声波提取法对胎菊中的绿原酸进行提取，尽量避免其在提取过程中的损失，确定最佳提取条件并建立了HPLC测定方法，为胎菊的质量监控提供一定的技术支持。

1 Chinese Pharmacopoeia Committee(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中华人民共和国药典).Beijing:China Medical Science Press，2005.Vol I，218.

2 Zhou Q(周群)，Yu XP(俞旭平)，Ren JJ(任江剑)，et al.Influence of different harvest methods and processing methods on quality of chrysanthemum morifolium.Mode Chin Med(中国现代中药)，2009，11(12):24-27.

3 Wu WH(吴卫华)，Kang Z(康桢)，Ouyang DS(欧阳冬生)，et al.Progresses in the pharmacology of chlorogenic acid.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2006，18:691-694.

4 Luo SZ(雒淑珍)，Lei YH(雷耀湖)，Zhao JR(赵继荣)，et al.Determination of chlorogenic acid in flos lonicerae by HPLC.Mode Agrl Sci Tech(现代农业科技)，2011，17:41-42.

5 Wu L(乌兰)，Zhang ZS(张泽生).Extraction and examination of chlorogenic acid from flos lonicerae.Food Sci(食品科学)，2005，26:130-134.

6 Yuan XY(袁晓艳)，Gao MZ(高明哲)，Wang K(王锴)，et al.Analysis of chlorogenic acids in Helianthus tuberosus Linn leaves using high performance liquid chromatography-mass spectrometry.Chin J Chrom(色谱)，2008，26:335-338.

7 Hu XJ(胡晓娟)，Gao ZQ(郜占青)，Zhang RP(张荣培)，et al.Determination of chlorogenic acid in jinju effervescent tablet by HPLC.Chin J of Spec Lab(光谱实验室)，2007，24:1013-1016.