逆转录环介导等温扩增技术检测南芥菜花叶病毒

郭立新， 谭 毅， 刘永丰， 邓丛良， 段维军， 许邹亮

（1.北仑出入境检验检疫局，宁波 315800；2.北京出入境检验检疫局，北京 101312；3.宁波出入境检验检疫局，宁波 315012；4.北京蓝谱生物科技有限公司，北京 100086）

南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）是豇豆花叶病毒科（Comoviridae）线虫传多面体病毒属（Nepovirus）成员。其寄主范围广泛，可侵染174属215种植物，引起最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸形、耳突［1］。ArMV主要经汁液摩擦和介体线虫传播，传播介体主要为异尾剑线虫（Xiphinema diversicaudatum），ArMV 也可通过种子、鳞球茎、块茎和苗木等无性繁殖材料远距离传播［1－2］。该病毒主要分布在荷兰、比利时等欧洲国家和美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、南非、日本，我国尚未有报道［1，3］。

目前，ArMV的检测主要采用生物学［4］、电子显微镜［4］、血清学［1，5－6］、RT－PCR［1－2，5－6］、实时荧光 RTPCR方法［1，7］，而未见有环介导等温扩增（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）技术检测的报道。LAMP技术是Notomi等［8］2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一个具有链置换特性的 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase），在等温条件下高效扩增靶基因，灵敏度和特异性高［8］。该方 法 已 应 用 于 病 毒［9－12］、类 病 毒［13］、细 菌［14］、真菌［15］及转基因［16］的检测。本研究根据南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因序列设计特异性引物，成功建立了ArMV的RT－LAMP检测体系，用于ArMV的快速检测。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

1份南芥菜花叶病毒阳性质控物，购自美国Agdia公司，简写为Ar－A；另1份南芥菜花叶病毒阳性质控物，购自德国DSMZ公司，简写为Ar－D；1份受ArMV侵染的唐菖蒲叶片，由北京出入境检验检疫局植物检疫实验室提供，简写为YP。3种可侵染大豆的病毒，即：番茄环斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）、烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）及南方菜豆花叶病毒（Southern bean mosaic virus，SBMV）阳性质控物，均购自美国Agdia公司。1份感染菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）的美国进境大豆种子，由宁波出入境检验检疫局植物检疫实验室提供。以上阳性质控物样品状态均为新鲜叶片经液氮处理，磨成粉末状。

1.1.2 分子生物学试剂

RNeasy Plant Mini Kit购自 Qiagen公司，TaKa－Ra One Step RNA PCR Kit（AMV）购自大连宝生物公司，Fluorescent Detection Reagent、RNA Amplification Kit 购 自 EIKEN CHEMICAL CO.，LTD.。RT－LAMP引物及 RT－PCR引物［2］由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2 主要仪器

LA－320C实时浊度仪。

1.3 方法

1.3.1 总RNA的提取

分别对样品及健康大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］叶片，使用 RNeasy Plant Mini Kit进行植物总RNA提取，具体操作见试剂盒说明书。用核酸蛋白质分析仪测A260及A280，计算核酸的浓度和纯度。

1.3.2 RT－LAMP引物的设计和合成

从GenBank调出所有南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因序列，利用DNAMAN 6.0.40软件进行比对分析，找出ArMV外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V4（http：∥primerexplorer.jp／elamp4.0.0／index.html）设计了5组引物，其中有2组不满足引物设计原则，再次通过对引物区段各分离物进行同源性比对，选择合成了其中2组（表1）。

表1 南芥菜花叶病毒RT－LAMP检测引物Table 1 Primers used in the detection of Arabismosaicvirusby RT－LAMP

1.3.3 RT－LAMP引物的筛选

以Ar－D、YP、Ar－A总RNA为模板，健康大豆叶片总RNA为阴性对照，水为空白对照，利用各组引物进行RT－LAMP检测，即在25μL反应体系中加入2μL Ar－FIP （20μmol／L），2μL Ar－BIP （20μmol／L），0.25μL Ar－F3 （20μmol／L），0.25μL Ar－B3（20μmol／L），12.5μL 2×Reaction Mix，1μL Enzyme Mix，2.5μL RNA，无 RNA酶的dH2O补至25μL。反应条件为：60℃60min。

1.3.4 RT－LAMP引物特异性检测

以ToRSV、TRSV、SBMV、BPMV 和 Ar－A 总RNA为模板，按1.3.3体系和条件进行RT－LAMP反应。

1.3.5 灵敏度对比试验

以Ar－D总 RNA 为模板，用 无 RNA 酶的dH2O稀释总RNA进行相对灵敏度检测，在25μL反应体系中，总 RNA分别为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg，进行实时 RT－LAMP反应。同时对稀释的RNA按试剂盒说明书进行普通RTPCR检测，即在25μL反应体系中加入2.5μL 10×One Step RNA PCR Buffer，5μL MgCl2（25mmol／L），2.5μL dNTP Mixture （各 10mmol／L），0.5μL RNase Inhibitor（40U／μL），0.5μL AMV RTase XL（5 U／μL），0.5 μL AMV－Optimized Taq （5U／μL），0.5μL引物ArMV1［2］（20μmol／L）（5′－TGCATATAT GCAGCCCTTGTACTTA－3′），0.5μL引物 ArMV2［2］（20μmol／L）（5′－CGATGTAACACCCGGGGTATT －3′），2.5μL RNA，无 RNA酶的dH2O补至25μL。反应条件为：50℃30min，94℃2min；然后94℃30s，58℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃10min。PCR产物用2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.6 ArMV的RT－LAMP目视检测

以Ar－D、YP、Ar－A总RNA为模板，健康大豆叶片总RNA为阴性对照，水为空白对照，进行RTLAMP目视荧光检测，即在25μL反应体系中加入2μL Ar2－FIP（20μmol／L），2μL Ar2－BIP（20μmol／L），0.25μL Ar2－F3 （20μmol／L），0.25μL Ar2－B3（20μmol／L），12.5μL 2×Reaction Mix，1μL Enzyme Mix，1LFluorescent Detection Reagent，2.5μL RNA，无RNA酶的dH2O补至25μL。反应条件为：60℃70min，95℃2min。

2 结果与分析

2.1 RT－LAMP引物的筛选

本研究所合成的2组引物，其中Ar2组引物仅能检出Ar－D、Ar－A分离物，Ar4组引物能检出 Ar－D、YP和Ar－A三个分离物（图1），故最终选择了Ar4组引物作为ArMV RT－LAMP检测的最佳引物（图2）。

图1 RT－LAMP检测最佳引物的筛选Fig.1 Screening of the optimal primers for RT－LAMP

2.2 RT－LAMP引物特异性检测

如图3所示，Ar4组引物有较强的特异性，5种大豆病毒中仅能检出ArMV，不能检出ToRSV、TRSV、SBMV和BPMV，与预期结果相符。

2.3 灵敏度对比试验

灵敏度试验结果显示，本试验所建立的RTLAMP检测方法最小检测限为20pg（图4），与RTPCR检测结果一致（图5）。

2.4 ArMV的RT－LAMP目视检测

RT－LAMP扩增结束后，在正常光照条件下，肉眼可观察到Ar－D、YP和Ar－A三个阳性分离物反应管颜色明显变为黄绿色，而空白对照与阴性对照反应管颜色没有改变（图6）。

3 讨论

目前，在LAMP反应不开盖的前提下，其结果判定方式主要有目视检查浑浊、目视检查染料颜色变化和浊度仪对LAMP反应进行实时监控这三种方法。目视检查浑浊法主要依据LAMP反应产生了大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀而使反应液呈现浑浊，但是当浑浊度较低时，肉眼很难察觉。利用实时浊度仪能够更加直观、精确地判定结果，但是需要使用特定的仪器设备，在试验研究阶段比较合适。目视检查染料颜色变化主要依据反应前体系中加入钙黄绿素来实现，钙黄绿素是一种螯合剂，反应前与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光，通过观察荧光的有无可判断是否有扩增［17］。比色分析既提高了肉眼的识别率，又可直接用于现场诊断，是最为简单方便的LAMP结果判定方式，适用于成熟方法的推广应用。本研究利用实时浊度仪对ArMV RTLAMP检测方法的引物进行了优选并进行了特异性及灵敏度等试验，成功建立了南芥菜花叶病毒的RT－LAMP检测方法，并在反应前向反应液中加入钙黄绿素，阴阳性结果颜色差别明显，易于现场判断。

本研究建立的ArMV实时浊度RT－LAMP检测方法与以往检测ArMV的方法相比，具有如下优点［8，13］：1、操作简单。RT－LAMP在60～65 ℃恒温条件下进行，不需要复杂仪器设备，只需维持恒温的水浴锅或金属浴就可完成。且可通过在反应液中加入钙黄绿素，反应结束后裸眼观察颜色变化，判定结果，不需电泳仪和紫外观测。2、特异性高。该技术通过4条引物识别靶基因6段不同的序列，在很大程度上提高了检测的特异性。3、高效灵敏。该技术在恒温条件下进行，不需通过温度循环实现基因扩增，且反转录可与PCR一步进行，节约了时间。60min内DNA能扩增到109～1010倍。其灵敏度与PCR相当。因此，RT－LAMP技术检测ArMV适合基层应用，有很好的应用前景。

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