万寿菊根乙酸乙酯粗提物对枣缩果病的抑菌稳定性研究

2013-09-11胡俊杰冀卫荣刘贤谦

植物保护 2013年2期

孟翔，胡俊杰，冀卫荣，刘贤谦＊

（1.广东省昆虫研究所，广州 510260；2.广州大学生命科学学院，广州 510006；3.山西农业大学林学院，太谷 030801）

植物是生物活性化合物的天然宝库，其产生的次生代谢产物超过40万种［1］，其中许多次生化学物质具有杀虫和（或）抑菌等生物活性［2］，在农业、医药上有着重要的研究价值。此外，植物源农药的活性成分除受自身遗传因子控制外、还受外界环境条件（如土壤、温度、光照、土壤pH值）的影响，及有地域性和季节性等变化［3－4］。所以，植物源农药稳定性的好坏将对新型农药的开发和有效利用产生重要影响。

万寿菊（Tagetes eracta Linn.）为一年生草本植物，广泛分布于全国各地，是近年来研究较多的杀虫植物之一。目前对于万寿菊生物活性研究对象多集中于害虫的防治，而关于万寿菊抑菌活性的研究则相对较少，目前报道的主要是农作物真菌性病害［5］。枣（Ziziphus jujuba Mill.）缩果病是近年来我国北方枣区发生的一种病害，常暴发流行，造成巨大的经济损失［6］。目前研究报道的枣缩果病病原菌主要有细交链孢菌［Alternaria alternata（Fr.）Keissler］、聚生小穴壳菌（Dothiorella gregaria Sacc.）、橄榄色盾壳霉菌（Coniothyrium olivaceumBon.）和一种细菌［7－8］。在山西壶瓶枣缩果病主要的致病真菌中也包括细交链孢菌［9］。本实验室已通过研究万寿菊根不同溶剂提取物对枣缩果病病原菌的抑菌活性，筛选出最佳粗提物－－乙酸乙酯粗提取物［6］，其对细交链孢菌的抑菌活性最高。但该提取物能否在田间防治枣缩果病中保持稳定的防效还未曾研究报道。为进一步研究该提取物在枣缩果病防治中的应用潜力，作者对万寿菊根乙酸乙酯粗提物对枣缩果病病原菌的抑菌效果作进一步研究，并对其不同条件下的稳定性进行了测定，以期为开发经济、安全、高效的万寿菊杀菌剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物材料

万寿菊根采自山西太谷阳邑乡回马村。采集时间2006年秋。将万寿菊根洗净、阴干，55℃烘干，粉碎机粉碎过60目筛，备用。

1.1.2 供试菌种

枣缩果病病原菌［7－8］：细交链孢菌［Alternaria alternata（Fr.）Keissler］为本实验室保存菌种。

1.1.3 试剂及仪器

乙酸乙酯（分析纯）、1mol／L HCl、1mol／L NaOH。

恒温水浴锅，250mL的具塞三角瓶，25mL具塞试管，2mL封口离心管。

1.2 方法

1.2.1 万寿菊根乙酸乙酯粗提取物的提取

振荡法［10］：称取10g万寿菊根粉，置于250mL的具塞三角瓶中，加入5倍体积的乙酸乙酯，常温25℃下振荡浸提3次，3次滤液合并后减压浓缩，直至呈浸膏状。试验重复3次，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 万寿菊根乙酸乙酯粗提取物抑菌物质稳定性测定

以万寿菊根乙酸乙酯粗提物为供试样品，以细交链孢菌为指示菌，无药剂培养基为对照，采用菌丝生长测定法测量菌落直径，并计算抑制率，重复3次。

菌丝生长测定［11］：取定量的提取物，以2～3滴吐温80做乳化剂并稀释为EC500.36mg／mL的浓度［5］，作为处理药剂，倒入直径9cm的培养皿中，与PDA培养基（1mL∶9mL）混合均匀备用。用6mm直径的打孔器从培养纯化好的菌种中采菌，用接种针接入药剂培养基中，并做空白对照。在25℃的恒温培养箱中培养，用十字交叉法记录菌丝生长直径，计算相对抑制率。重复3次。

1.2.2.1 热稳定性试验［12］

取样品18份，分别放入25mL的具塞试管中，设对照、未做任何处理的粗提取物（原药），其余16份分别在40、70、100℃水浴中及高压灭菌锅中加热（121℃），分别于10、30、60、120min取出，待自然冷却后检测活性。

1.2.2.2 光稳定性试验

取样品6份分别放入25mL的具塞试管中，设对照、未做任何处理的粗提取物（原药），其余4份分别在自然光下照射6、12、18、24h，检测活性。

1.2.2.3 紫外照射稳定性试验［13］

取样品6份，分别放入25mL的具塞试管中，设对照、未做任何处理的粗提取物（原药），其余4份分别置于超净工作台内悬挂的30W（辐射强度90μ W／cm2）紫外线杀菌灯管下距离40cm处10、20、30、60min，检测活性。

1.2.2.4 酸碱稳定性试验［12－14］

取样品11份分别放入25mL的具塞试管中，设对照、未做任何处理的粗提取物（原药），其余9份用1mol／L HCl、1mol／L NaOH 将样品分别调成pH3～12，然后将每份调好的样品分装成3个试管，每管1mL，即得到3组pH为3～12的样品，之后进行如下处理：

①第一组样品：室温（25±5℃）下放置2d，检测活性。

②第二组样品分别于60℃水浴加热，30、60、120min取样，取出后迅速冷却至室温，检测活性。

③第三组样品：分别于100℃水浴加热，30、60、120min取样，取出后迅速冷却至室温，检测活性。

1.2.2.5 耐储藏性试验［12］

将样品放在2mL封口离心管中，分别在－20、4、25、50℃的恒温条件下保存30d和120d后检测活性。

1.3 分析方法

利用EXCEL和DPS7.0统计分析软件对试验结果进行统计、方差分析、多重比较。

2 结果与分析

2.1 热稳定性

将万寿菊乙酸乙酯粗提取物分别在40、70、100℃水浴中加热和高温灭菌10、30、60、120min后，粗提取物对细交链孢菌菌落抑制表现各不相同。由图1所知：在40、70、100℃的加热处理中，同一处理时间，温度的升高对粗提取物的抑菌活性无明显影响。但短时间的温度提升（10min）可以提高粗提取物的抑菌活性，菌落平均抑制率为（84.29±1.35）%，较原药（73.27±1.31）%的抑菌活性高。随着粗提取物加热处理时间的延长，抑菌作用缓慢降低。不同时间高温灭菌（121℃）处理的粗提取物的抑菌活性均低于40～100℃不同时间处理和原药的抑菌活性，且降低明显。

图1 万寿菊乙酸乙酯粗提取物热稳定性Fig.1 The heat stability of T.eractaethyl acetate extract

2.2 光稳定性

将万寿菊乙酸乙酯粗提取物在自然光下照射6、12、18、24h后，其抑菌活性随光照时间的增加而增强，光照6、12、18、24h的万寿菊乙酸乙酯粗提取物对细交链孢菌菌落的抑制率分别为：（70.55±0.26）%，（72.95±1.24）%，（74.45±2.38）%，（74.70±0.98）%，较原药（70.28±3.47）%的抑菌活性高（图2）。

2.3 紫外照射稳定性

万寿菊乙酸乙酯粗提取物不受紫外光照时（即原药），对细交链孢菌的抑制作用最小，抑制率为（73.27±3.47）%，随着紫外光照时间的增加，抑制率也很快升高，到紫外光照60min时，万寿菊乙酸乙酯粗提取物抑制作用达（79.75±0.35）%（图3）。这与上述自然光照引起万寿菊乙酸乙酯粗提取物抑菌活性增强结果一致。

2.4 酸碱稳定性

在相同温度条件下，当万寿菊乙酸乙酯粗提取物pH为7～8时，其对细交链孢菌的抑制活性较在其他pH条件下高，且与原药抑制率（75.32±1.25）%相接近，无显著性差异；随着乙酸乙酯粗提取物酸碱性的增强，其抑制率逐渐降低。在不同温度条件下，同一pH的乙酸乙酯粗提取物对细交链孢菌的抑制率大小顺序为室温2d＞60℃＞100℃。在同一温度下（60℃，100℃），粗提取物随加热时间的增长，抑菌活性降低。差异显著性分析表明：当pH为7～8时，在60℃条件下加热处理30min的粗提取物对细交链孢菌抑制率相对较高，为（76.13±0.18）%和（75.67±1.95）%（表1）。

2.5 耐储藏性

万寿菊乙酸乙酯粗提取物在不同温度条件下保存对细交链孢菌的抑菌活性表现各不相同，由图4可知：随着储存温度的升高，粗提取物抑菌活性逐渐降低。其中，在25、50℃的恒温条件下保存30d和120d的粗提取物抑菌活性降低明显，保存30d抑制率分别为（66.32±3.73）%、（52.28±1.98）%。120d抑制率分别为（39.22±1.00）%、（33.72±1.14）%；在－20、4℃下保存30d抑菌活性无显著性变化，其抑制率为（73.5±3.82）%、（72.81±2.51）%；将保存时间延长至120d，前者抑制率为（73.22±2.91）%，后者为（69.3±4.75）%，无显著差异。

表1 万寿菊乙酸乙酯粗提取物酸碱稳定性1）Table 1 The acid and alkaline stability of T.eractaethyl acetate extract

图4 不同温度保存对万寿菊乙酸乙酯粗提取物稳定性的影响Fig.4 The effects of storage temperature on the stability of T.eractaethyl acetate extract

3 结论与讨论

从天然资源中寻找活性物质代替化学农药，开发新型的“环境和谐农药”已成为当前农药研究的重点，特别是在果树、蔬菜以及农产品贮藏等的病害防治中显得尤为重要，而植物源农药则是新农药开发的重要途径之一。万寿菊在我国资源丰富，并不断在农业病虫害防治中得到广泛研究和应用，研究发现，万寿菊根乙酸乙酯提取物对枣缩果病三种病原菌均具有较高的毒力［5］。可见，万寿菊不仅在农业病害防治中具有抗菌活性［15－16］，在枣树病害防治方面也具有广谱抗菌活性，这也预示着万寿菊在果树病害防治方面具有潜在的开发利用价值。

稳定性试验表明，万寿菊乙酸乙酯粗提取物的热稳定性良好，但耐高温性相对较差，在自然光照和紫外光照射条件下，不发生分解，且与众多报道的万寿菊粗提取物具有光活化杀虫活性结果［17］相一致，光照可能改变了万寿菊粗提取物的化学结构，提高了生物活性，从而抑制效果明显增强。这也证实了万寿菊根提取物经光照后，不仅在杀虫应用中具有较好的光活化作用，在抑菌作用中也同样具有较强的光活化作用。但其有效的抑菌成分是否与曾报道的万寿菊提取物的光活化杀虫活性主要依赖其所含的α－三连噻吩［18］成分相同还有待做深入研究。在酸碱环境下，当pH为7～8时，各条件粗提取物对细交链孢菌的抑制率相对较高；不同温度处理的粗提取物抑菌作用变化趋势是：室温下放置2d后＞60℃＞100℃，但在60℃条件下加热处理30min的粗提取物对细交链孢菌抑制率相对较高，与热稳定性试验结果一致。说明一定的温度和时间能提高粗提取物的抑菌活性。酸碱稳定性研究结果还显示：偏强酸和强碱性环境的粗提取物对细交链孢菌的抑制作用下降，当pH＝3和pH＝12时，结果显示粗提取物的抑菌活性较高，这可能是强酸强碱使粗提取物失活，直接作用导致抑菌率较高。而实际经强酸或强碱处理后的粗提取物本身的抑菌性能减小。此外，万寿菊乙酸乙酯粗提取物抑菌活性物质在4℃以下的低温条件下储藏稳定性较好，而高温条件下易损失活性物质。符合低温耐储藏规律。

由此我们得出开发、利用和储藏万寿菊乙酸乙酯粗提取物的最佳条件是：不能使用高温灭菌的方法避免提取物杂菌滋生，且储存温度不宜太高，4℃条件以下最好，储存时间不能过久，使用时不需要避自然光和紫外光，环境pH应保持在7～8左右。尽管这样可以降低粗提物活性减低的速度，但最好能尽快使用。

本试验仅限于在实验室离体研究，万寿菊根提取物对枣缩果病病原菌有效抑菌活性成分及作用机理等还有待做进一步的萃取和柱层析分离研究，其在田间试验中是否具有稳定的防效，能否在田间枣园广泛应用还需做具体环境的考察和试验验证。

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