甘肃省白银市保护地蔬菜根结线虫病病原鉴定

柳永娥， 李惠霞＊， 马金慧， 杨成德， 张广荣

（1.甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，兰州 730070；2.甘肃省白银市植保站，白银 730900）

根结线虫是一种永久性的内寄生病原线虫，能够对许多作物造成严重损害，具有广泛的地理分布和寄主范围，一旦侵入，会在土壤中长期存在，难以根除［1］。北方保护地蔬菜的种植为其创造了良好的寄生条件，使其在北方保护地中的传播和危害日益严重。甘肃省白银市保护地蔬菜种植面积广，仅白银区设施蔬菜种植面积达1980hm2，蔬菜种植种类主要为番茄、黄瓜、豇豆、茄子等，都是根结线虫的良好寄主。由于多年连作，或上述蔬菜之间轮作，使得根结线虫的防治更加困难，根结线虫已成为白银市具有重要经济性的病原线虫。由于线虫不同的种间存在显著的致病性差异，因此根结线虫种的鉴定是防治的基础，本文通过形态学结合同工酶测定对白银市保护地蔬菜主要种植区的根结线虫种类进行了鉴定，以期为防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2012年5月－7月在白银市保护地蔬菜主要种植区靖远县平堡乡、东湾镇、北湾乡和白银区强湾乡、水川镇及平川区宝积乡等采集了番茄、黄瓜、豇豆等几种蔬菜的根结线虫病根样（如表1所示），带回实验室，直接解剖获得雌虫，备用。其余病根样4℃保存。

表1 白银市蔬菜根结线虫样本采集信息Table 1 Information of root－knot nematode samples collected from greenhouse vegetables in Baiyin City

1.2 会阴花纹的制作

参考冯志新的方法制作会阴花纹［2］，会阴花纹制作好后在Nikon显微镜下观察并拍照，初步判断根结线虫的种类。

1.3 同工酶分析

1.3.1 两种同工酶的提取

酶浸提液为质量浓度20%蔗糖和2%Triton－100［3］，每个种群分别制作5条雌虫和单条雌虫的酶浸提液样，每样重复3次，5条雌虫加入50μL酶浸提液，单条雌虫加入20μL，然后用自制尖头磨面玻璃棒研碎雌虫，－20℃过夜使用或冷冻保存备用。

1.3.2 电泳

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳仪为DYY－5型，垂直板电泳槽为DYCZ－30型，凝胶板大小105mm×185mm，凝胶厚度1mm。分离胶和浓缩胶浓度分别为7.5%和3%，电极缓冲液为pH8.3的Tris－甘氨酸缓冲液。用20μL移液枪加样，每孔加15μL样品和5μL 1%溴酚蓝溶液，80V下电泳至溴酚蓝到达两胶边界，120V电泳至溴酚蓝距底部1cm处，结束电泳。

1.3.3 染色

参考陈永芳等的方法［4］染色。电泳结束后，取下凝胶，在37℃黑暗条件下染色，苹果酸脱氢酶（MDH）染色8～10min，酯酶（EST）染色30min。染色完毕后，蒸馏水冲洗干净，立即用10%的醋酸溶液固定1～3h，后用蒸馏水冲洗干净，并拍照保存。根据染色结果判读MDH和EST谱型，参照Esbenshade和 Triantaphyllou［4］的根结线虫酯酶和苹果酸脱氢酶的电泳谱型标准，计算两种酶的相对迁移率（Rf值），确定根结线虫的种类。

2 结果与分析

2.1 会阴花纹的观察

试验结果表明，靖远县6个根结线虫群体和白银区、平川区10个根结线虫群体的会阴花纹基本一致，具有如图1所示的特征（图1a、b），背弓高而方，线纹大多平滑，亦有波浪状线纹，无侧线。初步鉴定为南方根结线虫。

靖远县8个根结线群体和白银区1个根结线虫群体会阴花纹形态相似，背弓低圆或略高，线纹平滑，两条侧线明显，从尾区向外延伸，略呈“八”字形或基本在同一水平线上，有些尾端有明显的“涡”，如图1c、d所示。初步鉴定为爪哇根结线虫。

图1 白银市蔬菜根结线虫群体雌虫会阴花纹形态图Fig.1 Illustration of perineal patterns of root－knot nematode populations on vegetables in Baiyin City

2.2 同工酶测定

经同工酶电泳图谱观察，采自白银市的25个蔬菜根结线虫群体的苹果酸脱氢酶无论是多雌样品还是单雌样品表型完全一致，均为N1型（图2、图3），Rf值为0.24。酯酶图谱观察结果显示，靖远县6个根结线虫群体和白银区、平川区10个根结线虫群体多雌样和单雌样的酯酶图谱具有一致的表型，均为I1型（图2），Rf值为0.44，而其他8个靖远县根结线群体和1个白银区根结线虫群体酯酶图谱一致为J3型（图3），Rf值分别为0.44、0.52、0.56。

图2 南方根结线虫的同工酶表型Fig.2 MDH－EST phenotypes of single females of M.incognita

图3 爪哇根结线虫的同工酶表型Fig.3 MDH－EST phenotype of single females of M.javanica

将以上酯酶和苹果酸脱氢酶谱型观察结果和Rf值测量结果与Esbenshade和Triantaphyllou［4］的根结线虫酯酶和苹果酸脱氢酶的电泳谱型标准相比较，将靖远县的6个群体鉴定为南方根结线虫，8个群体鉴定为爪哇根结线虫，白银区和平川区的10个群体为南方根结线虫，1个群体为爪哇根结线虫。此判定结果与会阴花纹的鉴定结果一致，且每一群体均为单一群体，同一个大棚或温室中无复合侵染现象。

3 讨论

本研究利用形态学鉴定与同工酶技术相结合的方法鉴定出白银市部分蔬菜根结线虫群体为爪哇根结线虫，部分群体为南方根结线虫。这是首次在甘肃省发现爪哇根结线虫。爪哇根结线虫因其具有典型的会阴花纹特征和酯酶谱带类型，在鉴定中仅依据这两个特征就可达到准确鉴定的目的。Esbenshade和Triantaphyllou曾证明有94%的北方根结线虫，98%的南方根结线虫及100%的爪哇根结线虫仅依据其酯酶谱带就能确定其种类［4］，且现已证实根结线虫种的酯酶谱带特异性很稳定，可以用于4种常见根结线虫的鉴定。自2002年刘培磊首次在普通的电泳设备上实现单个雌虫苹果酸脱氢酶和酯酶两种同工酶的分离以来［5］，已有众多研究者将其应用于根结线虫的鉴定中，这为根结线虫的快速鉴定奠定了基础。

南方根结线虫（M.incognita）、花生根结线虫（M.arenaria）、爪哇根结线虫（M.javanica）和北方根结线虫（M.hapla）是引起蔬菜根结线虫的主要病原［6］，据相关报道南方根结线虫是危害我国蔬菜的优势种群［7－12］。在甘肃省蔬菜根结线虫的报道中，高赟、漆永红等通过形态学鉴定出南方根结线虫是危害河西地区番茄和黄瓜的病原［13－14］。由于根结线虫不同种之间存在显著的致病性差异［15］，因此准确鉴定根结线虫种类是防治的前提。甘肃省蔬菜根结线虫种类研究尚不全面，目前报道的只有河西地区的线虫种类，甘肃省气候条件和地理环境差异很大，其他地区的根结线虫群体还有待于进一步的鉴定。样品的快速鉴定显得尤为重要，通过蛋白质凝胶电泳进行苹果酸脱氢酶和酯酶的测定不失为一种简便、快速的鉴定方法，会阴花纹结合同工酶测定与单纯的形态学鉴定相比更为准确和可靠。

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