芦竹内源性寡糖素抑制蓝藻活性的作用

郭静雯，张忠山，王晓梅，韩志萍，张易祥

(1.湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州 313000;2.福建省化学生物学重点实验室，福建厦门 361000)

近年来，人们为了治理富营养化水域，利用高等水生植物与藻类的相互作用现象达到目的。目前已有较多植物的抑藻成分得到提取和鉴定，并在水域生态保护上起到重要作用［1－3］。本文报道了芦竹提取物对蓝藻 (蓝藻)的抑制作用，并从中提取分离出抑藻活性物质。

1 材料与方法

1.1 材料

芦竹采于浙江省湖州师范学院德清湖岸，清洗干净，烘干备用。铜绿微囊藻由生命科学学院细胞研究所获得，实验室扩大培养后用于试验。

试剂乙醇、苯酚、葡萄糖等，除特殊说明外，均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 芦竹组织提取液的制备

称取100 g干芦竹植株 (粉碎至0.3 mm)，置于三口烧瓶中，加入10倍蒸馏水于80℃提取3 h，提取液浓缩至100～200 mL，加入4倍体积无水乙醇。过滤，将上清液浓缩冻干，同时收集沉淀。分别记录醇溶物和水溶物，并各溶于水配制成10%浓度备用。

1.2.2 总糖含量的测定

准确称取标准葡萄糖50 mg于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。分别吸取0.05，0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mL各补蒸馏水至2.0 mL，然后加入1 mL 5%苯酚后快速加入浓硫酸5.0 mL。迅速摇匀，室温静置30 min后，于490 nm处测吸光度D。以2.0 mL蒸馏水作为空白组按照上述同样操作步骤进行。以标准葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标来绘制标准葡萄糖曲线。

分别取样品溶液适量补蒸馏水至2.0 mL，按照标准曲线步骤测定各浓度下的吸光度，并计算样品中的总糖含量。

1.2.3 样品分子量的测定

样品分子量测定采用高效液相色谱法进行，色谱柱为TSK G3000(300 mm×7.8 mm)，柱温为40℃。将样品配成2%的硫酸钠溶液上样分析，2.84%的硫酸钠溶液洗脱，流速为0.5 mL·min－1，示差检测器检测。标准多糖采用一系列的不同分子量的右旋多糖酐，其分子量为2 500～2 000 000 u。

1.2.4 样品抑藻活性试验

将样品分别配成浓度为0.01%，0.05%，0.50%和5.00%的水溶液，加入到装有BG-11培养基 (预先高温高压灭菌)的培养瓶中，每瓶接种入3 mL处于对数生长期的铜绿微囊藻细胞悬液。以蒸馏水为对照，每处理设2个重复。接种后置专用培养架上培养，培养温度为25℃，光照强度为2 000 lx，光暗周期比为12 h∶12 h。

1.2.5 蓝藻生长量的测定

分别于接种后第0～19天，在665和649 nm两个波长下测定蓝藻吸光度 (D665和D649)，以D665的变化表示蓝藻细胞的生长情况。

1.2.6 叶绿素a的测定

叶绿素a的含量用比色法测定。色素的浓度=13.95D665－6.88D649。

1.2.7 数据处理

采用WPS软件进行数据处理和作图，应用SPSS 19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 样品提取液

将芦竹叶提取液加入乙醇后，出现大量白色沉淀。上清液回收乙醇后冷冻干燥呈黄色，在空气中暴露后迅速吸水呈现油状，加水迅速溶解。两者分别记录为醇溶物和水溶物，但是均在水中可溶。

2.2 样品总糖含量

采用苯酚－硫酸法测得葡萄糖标准曲线，当浓度0.002～0.010 mg·mL－1时线性关系最好。线性回归方程为y=49.624x－0.004 6(R2=0.999 9)。在试验条件下探索得取350 μL样品溶液补蒸馏水至2.0 mL，分别测出的芦竹叶上清液提取物和沉淀提取物的吸光度为最适吸光度。由标准曲线计算出芦竹叶醇溶物和水溶物中总糖含量分别为0.14%和54.30%。

2.3 样品分子量

经过高效凝胶色谱测定，醇溶物和水溶物的重均分子量分别为547和3 359 u。结合总糖含量测定结果，可得出水溶物应为寡糖素类化合物。

2.4 芦竹叶上清液提取物对蓝藻生长的影响

图1表明，0.01%和0.05%的芦竹叶上清液提取物对蓝藻有一定的促进作用，且促进作用呈显著增大的趋势。5.00%的芦竹叶上清液提取物则起稳定的抑制作用。而0.50%的芦竹叶上清液提取物对蓝藻生长的影响是复杂的。接种第0～15天有明显的促进作用，从第16天开始又显示抑制作用，且抑制的程度大小也有波动。

2.5 芦竹叶沉淀提取物对蓝藻生长的影响

观察图2可知，0.01%和0.05%的芦竹叶沉淀提取物对蓝藻生长有一定的促进作用，且两者的促进程度相类似。在接种的第6～11天，0.50%的芦竹叶沉淀提取物有小范围的波动，但大体上呈抑制作用。5.00%的芦竹叶沉淀提取物则从第4天开始呈平稳的抑制作用。

图1 不同浓度上清液提取物吸光度随时间的变化

图2 不同浓度沉淀提取物的吸光度随时间的变化

由图3看出，叶绿素含量随天数有明显的变化，即反映的是接种蓝藻的生长情况。与图1对比，曲线呈类似的变化趋势，可推断蓝藻出现不同的生长情况是因为在培养基内加了芦竹叶上清液提取物的缘故。而不同浓度上清液提取物对蓝藻生长的影响是不同的，基本符合高浓度抑制和低浓度促进的规律。对比图2，4曲线，也能得到上述结论。

图3 上清液提取物的叶绿素含量随时间的变化

图4 沉淀提取物的叶绿素含量随时间的变化

3 小结和讨论

近年来国内外学者大多数利用植物种植水［2，4］和植物提取物［5－7］进行藻类的化感作用研究。本研究表明，芦竹植物器官组织不同物质具有不同的抑藻效果。试验表明，芦竹的水提取物中含有糖类物质，初步推测为纤维寡糖，具有一定抑藻活性，其结构有待于深入研究。芦竹在江浙地区的水体岸边具有较广泛的分布，在富营养化水体中种植挺水植物芦竹，不仅可吸收利用富营养化水体中的氮和磷，以及芦竹释放的抑藻化感物质，还可直接抑制蓝藻的生长。因此，本研究可为探索切实可行的富营养化水体的生态治理提供科学依据。

［1］陈建中，李利芳，张海洋，等．芦竹和睡莲对铜绿微囊藻的生长抑制效应 ［J］．环境科学与技术，2011，34(7):35－37.

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［3］戴树桂，赵凡，金朝晖，等．香蒲植物提取物的抑藻作用及其分离鉴定［J］．环境化学，1997，16(3):268－271.

［4］陈卫民，张清敏，戴树桂．苦草与铜绿微囊藻的相互化感作用 ［J］．中国环境科学，2009，29(2):147－151.

［5］丁惠君，彭祺，张维昊，等．三种湿生植物对微囊藻的化感作用初步分析 ［J］．环境科学与技术，2007，30(4):6－10.

［6］冯菁，朱擎，吴为中，等．稻草浸泡液对藻类抑制作用机制 ［J］．环境科学，2008，29(12):3376－3381.

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