HPLC法测定蒙药希合日希精阿日乐嘎其(降糖1号)中羟基红花黄色素A的含量

2013-09-11赵梦中靖彩霞葛根塔娜

中国民族医药杂志 2013年8期

赵梦中靖彩霞闫婧葛根塔娜

(1．包头市食品药品检验检测中心，内蒙古包头 014060; 2．包头市不良反应监测中心，内蒙古包头 014030)

希合日希精阿日乐嘎其(降糖1号)为黄柏、栀子、香附、诃子、川楝子、红花等11味药组成的复方制剂，用于治疗糖尿病。为了制定蒙药质量标准，达到有效控制制剂内在的质量，采用高效液相色谱法建立了含量测定方法。以羟基红花黄色素A作为测定指标，通过实验摸索，确定了比较理想的色谱条件。并经过方法学考察及阴性对照实验，表明该方法操作简单，重现性好，专属性强。方中其它组分对红花中的有效成分羟基红花黄色素A的测定无干扰，能够控制该制剂的质量。

1 仪器与试药

1．1 仪器:岛津 LC—10ATvp泵，SPD－10Avp型检测器，岛津CLASS－VP工作站，sartorious BP211D型电子天平。UV－1100型紫外分光光度仪(北京瑞利分析仪器公司)

1．2 试剂与试药羟基红花黄色素A对照品(批号:111637－200905，供含量测定用):中国食品药品检定研究院;乙腈为色谱纯(天津市光复精细化工研究所)、甲醇为色谱纯(天津市光复精细化工研究所)，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。样品由鄂尔多斯市乌审旗蒙医院提供(批号:090416、090518、090724)，模拟样由包头市食品药品检验检测中心制备。

2 实验方法与结果

2．1 色谱条件:色谱柱 Agilent TC－C18柱(150mm×4．6mm，5μm)色谱柱，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。以甲醇－乙腈－0．7%磷酸溶液(26:2:72)为流动相，检测波长403nm，柱温25℃。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备:精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，加25%甲醇制成每1m l含30μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备:取本品粉末约2．2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇溶液50mL，称定重量，超声处理(功率350W，频率40kHz)40民，取出，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照试验:按本品的处方比例并以相同工艺制备不含红花的阴性样品。按2．1．3供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。在2．1．1项色谱条件下，精密吸取阴性对照溶液、供试品溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。测得结果为:阴性对照色谱图中在与羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明其它组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰。见图1。

图1 HPLC色谱图

2．2 线性关系考察:取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成每1mL含0．6mg的溶液(实际为34．29mg→50mL 的%甲醇，即得．6858mg·mL－1)，作为对照品溶液;精密量取上述标准对照品溶液0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4mL，分别置mL 量瓶中，加% 甲醇至刻度，摇匀。精密吸取10μL注入色谱仪测定，以峰面积对浓度进行回归分析，结果羟基红花黄色素A在0．1372～0．9601μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为:Y=32464X+15043 r=1。

2．3 精密度试验:精密吸取上述羟基红花黄色素A对照品溶液10μL，连续进样6次，测得羟基红花黄色素A峰面积，计算RSD为2．2%。说明该方法有良好的精密度。

2．4 稳定性试验:取同一份供试品溶液，分别在0h、4h、8h、12h进行测定，结果可见，羟基红花黄色素A在12h内的峰面积积分值基本稳定不变，RSD%为1．3%。该试验稳定性良好。

2．5 重复性试验:取同一批号(模拟样批号090416)供试品6份，各约2．3g，精密称定，分别按2．1．3项下制成供试品溶液，按2．1．1项下色谱条件测定羟基红花黄色素A含量，平均含量为．733mg·g－1，RSD 为．52%．结果表明，该试验重复性良好。

2．6 回收率试验:取9份已知羟基红花黄色素A含量供试品(批号，含量．733mg·g－1)，各约．2g，精密称定，分别置9个具塞锥形瓶中，分成3组每组3份，每组分别精密加入浓度为0．3606mg·mL－1(配制为:19．64mg×0．918/50mL)的羟基红花黄色素A对照品溶液各1、2、3mL(约相当于供试品含有量的50%、100%、120%)及相应%甲醇溶液各49、48、47m L，分别按2．1．1 项下色谱条件测定每份供试品羟基红花黄色素A含量，计算回收率，结果见表1。

表1 羟基红花黄色素A回收率试验结果表(n=3)

2．7 样品含量测定:批号不同的两批样品和一批模拟样品，按“2．1．2”项“2．1．3”项下制成对照品溶液和供试品溶液。精密吸取羟基红花黄色素A对照品溶液、供试品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，按2．1．1项下色谱条件测定，计算羟基红花黄色素A的含量。测定结果见表2。

表2 样品中羟基红花黄色素A含量测定结果

3 讨论

3．1 流动相的选择:参照中国药典2005年版一部“红花”含量测定项下羟基红花黄色素A的测定方法，以甲醇－乙腈－0．7%磷酸溶液(26:2:72)为流动相进行流动相条件摸索。结果供试品色谱中的羟基红花黄色素A具有较好的分离度，并具较适合的保留时间和理论板数，羟基红花黄色素A的理论板数约为2500，故将流动相定为甲醇－乙腈－0．7%磷酸溶液(26:2:72)。

3．2 检测波长的选择:精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，用甲醇制成1mL含30μg的溶液，在200～500nm波长范围扫描。结果羟基红花黄色素A在403．5nm处有最大吸收。参照中国药典2005年版一部“红花”含量测定项下羟基红花黄色素A的测定方法，用403nm作为检测波长。通过实验摸索，分离效果较好，阴性对照色谱图中在与羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明其它组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰，故选用403nm作为检测波长。

3．3 提取溶剂、提取效率及提取溶剂加入量的考察:

3．3．1 提取溶剂的选择:参照《中国药典》2005年版一部“红花”项下的羟基红花黄色素A含量测定方法，选用25%甲醇作为提取溶剂。

3．3．2 提取效率的考察:以25%甲醇作为提取溶剂进行超声提取(功率350W，频率40kHz)，为保证被测成分提取完全，实验中考察了超声提取30min、40min和50min不同超声提取时间对提取效率的影响，结果超声处理30min、40min和50min羟基红花黄色素A的含量基本一致，故超声提取时间定为40min。

3．3．3 提取溶剂加入量考察:在取样量一致的情况下，提取过程中，对溶剂(25%甲醇)加入量25mL、50mL、75mL进行考察，结果用25mL溶剂的样品羟基红花黄色素A含量较低，用50mL和75m l溶剂的样品羟基红花黄色素A含量基本一致，提取完全，故确定提取溶剂加入量为50mL。

3．3．4 曾采用高效液相色谱法测定处方中栀子药材所含成分栀子苷的含量及黄柏药材所含盐酸小檗碱的含量，结果阴性都有干扰