siRNA沉默p28GANK对结肠癌细胞增殖的影响

蔡炜龙 许洪宝 汪伟民

浙江省湖州市中心医院普外科(313000)

结肠癌是消化道常见恶性肿瘤之一。全球范围内，结肠癌的发病率在恶性肿瘤中位居第三位，严重影响人类健康［1］，其发病机制与年龄、环境、家族史、结肠疾病史、遗传易感性等因素有关，是一个多阶段、涉及多病程改变的逐渐积累的复杂过程。目前结肠癌的治疗以外科手术为主，尚缺乏疗效显著的内科药物治疗手段。本课题的前期研究［2］发现p28GANK在结肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁非癌组织，且与肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移、Dukes分期相关，提示p28GANK可能在结肠癌恶性进展过程中起重要作用。RNA干扰(RNA interfering，RNAi)现象是一种序列特异性、转录后基因沉默的过程。在哺乳动物细胞中，小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可有效诱导RNAi现象，从而抑制目的基因表达。本研究应用慢病毒携带siRNA表达载体沉默p28GANK在结肠癌细胞株HT29中的表达，探讨p28GANK在结肠癌发生、发展过程中的作用，以期为结肠癌的生物治疗提供新靶点。

材料与方法

一、细胞株、主要试剂

人结肠癌细胞株HT29(美国ATCC公司)传代培养于含10%胎牛血清以及1%青霉素-链霉素双抗(HyClone公司)的 RPMI1640培养基中;针对p28GANK基因的慢病毒携带的siRNA载体(目的序列:5’-CTG ACC AGG ACA GCA GAA C-3’)、不含siRNA的对照病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司构建)［慢病毒均带有绿色荧光蛋白(GFP)编码基因］;兔抗人p28GANK多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);β-actin抗体(美国Sigma公司);辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗、细胞裂解液、ECL发光试剂盒、甲基噻唑基四唑(MTT)、甲紫、碘化丙啶(PI)染液(北京中山生物技术有限公司)。

二、方法

1.慢病毒转染:取对数生长期的HT29细胞以胰酶消化，5×103/孔接种于96孔板，于培养箱中(5%CO2、37℃)培养24 h，去除上清液，以无血清培养基清洗一次，每孔再加入0.6 mL无血清培养基，将针对p28GANK基因的siRNA慢病毒、对照病毒、RPMI1640培养基5 μL/孔加入孔中，轻摇至均匀，于培养箱中培养6 h后去除上清液，加入含1%青霉素-链霉素双抗的10%胎牛血清培养基，待细胞融合度达到80%时，以胰酶消化细胞，采用流式细胞术分选带有绿色荧光细胞继续培养48 h，荧光显微镜下随机选取5个视野(×100)计数绿色荧光细胞，绿色荧光细胞数/总细胞数≥95%表明转染细胞株构建成功，将 siRNA慢病毒、对照病毒和RPMI1640培养基转染的细胞株分别命名为Si-HT29、Con-HT29、HT29 细胞株。

2.蛋白质印迹法:以细胞裂解液抽提 HT29、Con-HT29、Si-HT29 细胞总蛋白，取 200 μg蛋白质于95℃加热变性5 min，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，依次进行转膜、封闭，加入兔抗人p28GANK多克隆抗体(1∶100)、β-actin 抗体(1∶300)，4 ℃孵育过夜，室温下复温30 min后以PBS清洗3次，分别加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶2000)、羊抗鼠IgG二抗(1∶3000)孵育60 min，PBS再次清洗2次，加入ECL发光液显色并定影，采用Bandscan 5.0软件行条带灰度分析，取p28GANK蛋白与内参的灰度比值表示其相对表达量。

3.MTT法:取对数生长期的 HT29、Con-HT29、Si-HT29细胞，以胰酶消化，制备细胞悬液，以1×103/孔接种于96孔板，每组细胞设3个复孔，分别培养1、2、3、4、5、6、7 d 后，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL，常温静置4 h后去除上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，低速振荡10 min。以酶联检测仪测定490 nm波长处各孔吸光度(A)值，绘制细胞生长曲线。

4.平板克隆实验:取对数生长期的HT29、Con-HT29、Si-HT29细胞制备细胞悬液，以500/孔接种于6孔板，培养7 d后以PBS冲洗，4%甲醛固定10 min，甲紫染色10 min，以自来水冲洗。于光学显微镜下(×100)计数细胞克隆数量，每组细胞重复三次。

5.流式细胞术检测细胞周期:取对数生长期的HT29、Con-HT29、Si-HT29细胞，以胰酶消化，然后1000 r/min(离心半径10 cm)离心5 min后去除上清液，加入预冷的PBS重悬细胞，再次离心(参数同前)，去除上清液，加入70%乙醇于4℃冰箱过夜，离心(参数同前)5 min，去除上清液，再次加入PBS清洗，加入PI染液于4℃冰箱避光孵育30 min，以流式细胞仪检测细胞周期。每组细胞重复三次。计算细胞增殖指数(PI)，PI=(S+G2)/(S+G2+G0/G1)。

三、统计学分析

结 果

一、p28GANK蛋白表达水平

蛋白质印迹法检测结果显示，Si-HT29细胞中p28GANK蛋白表达水平显著低于HT29、Con-HT29细胞(P＜0.05)，HT29、Con-HT29细胞间差异无统计学意义(P＞0.05)(见图1)。

二、细胞增殖能力变化

MTT法检测结果显示，培养第2 d时，HT29、Con-HT29、Si-HT29细胞增殖速度相比差异无统计学意义(P ＞0.05)，培养第3～7 d时，Si-HT29细胞增殖速度较HT29、Con-HT29细胞显著减缓(P＜0.05)，HT29、Con-HT29 细胞间差异无统计学意义(P ＞0.05)(见图2)。

图1 HT29、Con-HT29、Si-HT29细胞的p28GANK蛋白表达情况(蛋白质印迹法)

图2 HT29、Con-HT29、Si-HT29细胞生长曲线图

三、细胞克隆形成能力

平板克隆实验结果显示，培养7 d后，HT29、Con-HT29、Si-HT29细胞形成克隆的数量分别为110.31 ±12.52、109.92 ± 6.51、33.73 ± 9.75，Si-HT29细胞克隆数量较HT29、Con-HT29细胞显著减少(P ＜0.05)，HT29、Con-HT29细胞间差异无统计学意义(P ＞0.05)(见图3)。

四、细胞周期变化

流式细胞术检测结果显示，与HT29、Con-HT29细胞相比，Si-HT29细胞中G0/G1期细胞比例显著增多，S期细胞比例显著减少，PI值显著降低(P＜0.05)(见图4)。

图3 HT29、Con-HT29、Si-HT29细胞平板克隆形成结果

讨 论

图4 流式细胞术检测细胞周期以及PI值

结肠癌的演变过程涉及多因素、多分子信号转导通路，一部分分子在其中发挥关键作用，针对这些关键分子采取生物靶向治疗，是提高结肠癌治疗效果的有效方法。p28GANK又名Gankyrin或PSMD10，定位于人类染色体Xq22.3，最早从肝细胞癌组织中由消减杂交技术分离得来，具有6个重复的ankyrin结构域蛋白，含226个氨基酸，在哺乳动物中高度保守［3～5］。除脑和心脏外，p28GANK 在人体正常组织中多为阴性表达。研究［6～8］表明，p28GANK 在肝癌、食管癌、胰腺癌中表达上调，在肿瘤恶性进展过程中发挥重要作用，下调p28GANK表达能抑制肿瘤细胞恶性进展过程。本课题的前期研究［2］显示，p28GANK表达与结肠癌恶性程度相关，其高表达提示患者预后不良。p28GANK可作为结肠癌诊断和预后判断的指标，是结肠癌潜在的治疗靶点。

siRNA技术可使目标基因转录后沉默，具有显著下调目的基因表达的作用，是目前研究基因的重要方法［9］。慢病毒作为表达载体具有无毒、转染效率高的特性［10］。本研究构建了慢病毒携带siRNA作为下调p28GANK表达的工具，该载体包含GFP编码基因，转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光，可有效判断转染效率，且本研究通过绿色荧光，应用流式细胞术进一步分选阳性转染细胞，使阳性转染率达95%以上。蛋白质印迹法检测发现，siRNA慢病毒显著抑制了p28GANK在结肠癌细胞株HT29中的表达水平，提示Si-HT29细胞株构建成功。以HT29细胞和Con-HT29细胞为对照，行MTT法检测发现，Si-HT29细胞增殖速度显著减缓;行平板克隆实验检测发现，Si-HT29细胞平板克隆形成能力显著降低;进一步应用流式细胞术检测细胞周期变化，结果显示Si-HT29细胞中G0/G1期细胞比例显著升高，而S期细胞比例显著降低，通过计算PI值证实Si-HT29细胞增殖能力显著降低。上述研究结果与在食管癌、胰腺癌等肿瘤细胞中下调p28GANK水平的效应一致，提示p28GANK可作为恶性肿瘤生物治疗的重要靶点。

多项研究［11，12］显示，p28GANK 能够通过激活周期素依赖性蛋白激酶4(CDK4)，促进癌基因Rb编码蛋白磷酸化失活。Higashitsuji等［13］的研究发现，p28GANK可与癌基因MDM2结合，增强MDM2的生物活性，导致其对抑癌基因p53的降解能力增加。此外，Man等［14］的研究发现，在肺癌细胞中p28GANK可通过调节RhoA/ROCK信号转导通路促进Ras活化，后者在肿瘤发生过程中起重要作用。CDK4激活、Rb磷酸化以及抑癌基因p53降解均可导致细胞阻滞于G1期，降低细胞增殖能力［11］。此与本研究结果一致，下调p28GANK表达导致结肠癌HT29细胞增殖抑制、克隆形成能力降低，细胞发生G1期阻滞。Kim等［15］的研究发现，p28GANK在乳腺癌组织中表达上调，其表达水平与癌基因ErbB2呈正相关。下调p28GANK在乳腺癌细胞中的表达，可显著抑制肿瘤细胞增殖能力。此外，在肝癌细胞中下调p28GANK的表达可抑制上皮-间质细胞转化，从而抑制肝癌细胞转移能力［16］。Zhen等［16］的研究发现，p28GANK可通过激活Rac1促进乳腺癌细胞转移［17］。上述研究结果提示p28GANK在肿瘤转移中亦扮演重要角色。有关p28GANK在结肠恶性肿瘤增殖、侵袭以及转移中的作用机制有待进一步深入研究。

总之，本研究应用慢病毒携带siRNA表达载体有效下调了p28GANK在结肠癌细胞株HT29中的表达水平。下调p28GANK表达后，结肠癌细胞增殖能力降低，细胞周期阻滞，提示p28GANK可作为结肠癌生物治疗的新靶点。

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