Periostin过表达诱导人胃癌细胞化疗耐药性的机制研究

李 滨 汪丽燕 蒋欢欢

桂林医学院附属医院消化内科(534001)

Periostin又称成骨细胞特异性因子2(osteoblast-specific factor 2，OSF-2)，是一种基质特异性细胞黏附分子，其cDNA最初是在小鼠成骨细胞株MC3T3-E1中被克隆和鉴定的［1］。既往研究发现periostin过表达与多种恶性肿瘤，如乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、头颈部鳞癌的发生、发展有关［2］。除促进细胞黏附外，periostin还具有调控肿瘤细胞生长、增殖、迁移、侵袭、血管生成等作用，并与肿瘤细胞的化疗耐药有关［3～9］。顺铂(cisplatin)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)为常用胃癌化疗药物［10～12］，然而由于肿瘤细胞化疗耐药性的获得［13］，相当一部分胃癌患者化疗效果不甚理想。因此，探讨胃癌化疗耐药的产生机制对提高化疗效果、延长患者生存期具有重要意义。有研究显示periostin与受体结合后，可通过PI3K/Akt通路发挥其生物学效应［2］，另有研究发现基因突变或缺失所致的p53失活是胃癌细胞化疗耐药的重要机制之一［14］。本课题组前期研究［15］发现 periostin过表达可增强人胃癌细胞株SGC-7901对顺铂和5-Fu诱导的细胞凋亡的抵抗能力，诱导胃癌细胞产生化疗耐药，本研究对periostin过表达是否系通过激活Akt通路抑制p53表达而诱导人胃癌细胞对顺铂和5-Fu的耐药性进行了探讨。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂、仪器

人胃癌细胞株SGC-7901(American Type Culture Collection)，表达人periostin全长序列的重组质粒pcDNA3.1-periostin(哈尔滨医科大学附属第四医院消化内科构建、保存［16］)。顺铂、5-Fu(Sigma-Aldrich Co.)，Akt特异性抑制剂 MK-2206(Selleck Chemicals)，兔抗人Akt多克隆抗体、兔抗人磷酸化Akt(p-Akt)多克隆抗体、小鼠抗人p53单克隆抗体、小鼠抗人 β-actin单克隆抗体、兔 IgG-HRP、小鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)，Amersham ECL Plus蛋白质印迹法检测试剂盒(Life Sciences，GE Healthcare)，BD PharmingenTMAnnexin V∶FITC凋亡检测试剂盒(BD Biosciences)。Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)，EPICS®ALTRATM流式细胞仪(Beckman Coulter，Inc.)。

二、方法

1.细胞培养:SGC-7901细胞使用RPMI1640完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养，每2～3 d换液一次。细胞生长至70% ～80%融合时，按1∶3的比例进行传代。取对数生长期细胞进行实验。

2.稳转细胞株的构建:稳定转染 pcDNA3.1-periostin重组质粒和稳定转染 pcDNA3.1空载体SGC-7901细胞株的构建步骤参照本课题组前期研究［16］。

3.细胞处理:periostin稳转组和空载体稳转组SGC-7901细胞分别以5 μmol/L顺铂或10 μmol/L 5-Fu处理24 h或不予化疗药物处理，其中periostin稳转组在化疗药物处理前可接受或不接受1 μmol/L MK-2206(Akt特异性抑制剂)预处理30 min。同时设置未予转染、亦未予化疗药物处理和未予转染、但予化疗药物处理的对照组。

4.蛋白质印迹法检测总Akt、p-Akt、p53蛋白表达:将各组细胞按5×105/孔接种于12孔板并予相应处理，细胞密度达到70% ～80%时收集细胞，加入适量细胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃ 14 000×g离心15 min，吸取上清液，液氮速冻，－80℃保存备用。BCA法蛋白定量，取20 μg总蛋白上样，10%SDS-PAGE电泳1.5 h，转移至 PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(1∶1000)室温孵育2 h，1×TBST洗膜10 min×3次，加入HRP标记的二抗(1∶2000)室温孵育 1 h，1×TBST洗膜 10 min×3次，按Amersham ECL Plus蛋白质印迹法检测试剂盒说明书进行显影、定影操作，凝胶图像分析系统扫描、观察。

5.流式细胞术检测细胞凋亡:将经相应处理的各组细胞制成1×106/mL的细胞悬液，取100 μL移入流式细胞仪专用试管，预冷PBS洗涤3次，300×g离心10 min，弃上清液，按 BD PharmingenTMAnnexin V∶FITC凋亡检测试剂盒说明书进行操作，染色完毕后立即上流式细胞仪检测。激发波长488 nm，发射波长525 nm(Annexin V-FITC染色阳性细胞)和620 nm(PI染色阳性细胞)。Annexin VFITC染色阳性为早期凋亡细胞，PI染色阳性为坏死细胞，两者均阳性为晚期凋亡细胞，两者均阴性为正常活细胞。

三、统计学分析

结 果

一、Periostin过表达激活SGC-7901细胞的Akt通路

蛋白质印迹法检测显示，periostin稳转组SGC-7901细胞p-Akt蛋白表达明显高于空载体稳转组和未予转染的对照组，三组间总Akt蛋白表达无明显差异(见图1)，表明periostin过表达可诱导 SGC-7901细胞Akt磷酸化水平增加，激活Akt通路。

图1 各组 SGC-7901细胞总 Akt、p-Akt蛋白表达比较(蛋白质印迹法)

图2 各组经顺铂或5-Fu处理的SGC-7901细胞p53蛋白表达比较(蛋白质印迹法)

二、Periostin通过激活Akt通路抑制SGC-7901细胞p53表达

蛋白质印迹法检测显示，在经顺铂或5-Fu处理的各组SGC-7901细胞中，periostin稳转组p53蛋白表达明显低于空载体稳转组和未予转染的对照组，而经Akt特异性抑制剂MK-2206预处理的periostin稳转组细胞，p53蛋白表达下调有所逆转(见图2)，表明抑制Akt可在一定程度上逆转periostin对p53表达的抑制作用，periostin至少部分是通过激活Akt通路抑制SGC-7901细胞的p53表达。

三、Akt通路对periostin在SGC-7901细胞中抗凋亡活性的作用

流式细胞分析显示，在经顺铂或5-Fu处理的各组SGC-7901细胞中，periostin稳转组细胞凋亡率显著低于空载体稳转组和未予转染的对照组，而经Akt特异性抑制剂MK-2206预处理的periostin稳转组细胞，细胞凋亡率降低有所逆转(见图3)，表明抑制Akt可在一定程度上逆转periostin诱导的凋亡保护效应，Akt通路活化对periostin在SGC-7901细胞中的抗凋亡活性具有重要意义。

图3 各组SGC-7901细胞顺铂或5-Fu诱导的细胞凋亡率比较(流式细胞分析)

讨 论

肿瘤细胞耐药性的获得是肿瘤治疗失败的主要原因之一，最终导致肿瘤复发和死亡。尽管围绕胃癌耐药机制的研究已取得一定进展，但其确切机制迄今尚未完全阐明。本课题组前期研究［15］探讨了periostin基因对胃癌化疗敏感性的调控作用，结果显示过表达外源性periostin可增强人胃癌细胞株SGC-7901对顺铂和5-Fu诱导的细胞凋亡的抵抗能力，伴线粒体细胞色素C释放、凋亡效应分子caspase-3激活及其底物PARP剪切减少，以及促凋亡蛋白Bax表达下调、抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调、肿瘤抑制蛋白p53表达下调(部分研究结果未发表)。因此，periostin过表达可能为人胃癌细胞产生化疗耐药的原因之一。本研究在前期研究的基础上探讨了periostin过表达诱导人胃癌细胞化疗耐药性的可能机制。

PI3K/Akt通路活化对于肿瘤细胞抵抗凋亡刺激而存活具有重要意义。Akt由PI3K激活后，可直接影响凋亡机制，或影响凋亡刺激引起的转录因子活性改变［17］。有研究［18］发现结肠癌中过表达的periostin可激活Akt/PKB通路，进而促进细胞存活和肿瘤转移性生长。同样，在非小细胞肺癌中，缺氧引起的periostin过表达可通过激活Akt/PKB通路促进肿瘤细胞在低氧环境中存活［19］。本研究结果显示periostin过表达可诱导SGC-7901细胞Akt磷酸化水平增加，但对总Akt无明显影响，表明periostin过表达可激活人胃癌细胞的Akt通路。进一步检测Akt通路活化在periostin抑制p53表达中的作用，发现在经顺铂或5-Fu处理的SGC-7901细胞中，periostin可抑制化疗药物诱导的p53表达上调，而Akt特异性抑制剂预处理可在一定程度上逆转periostin对p53表达的抑制作用，表明periostin至少部分是通过激活Akt通路抑制人胃癌细胞的p53表达。最后，本研究探讨了periostin的抗凋亡活性是否依赖于激活Akt通路，结果显示periostin可抑制顺铂和5-Fu诱导的SGC-7901细胞凋亡，而Akt特异性抑制剂预处理可在一定程度上逆转periostin诱导的凋亡保护效应，表明Akt通路活化对periostin在人胃癌细胞中的抗凋亡活性具有重要意义。

p53是细胞信号转导网络中的重要节点分子，其活化后可经由广泛的信号网络诱导凋亡相关靶基因转录，通过外源性死亡受体途径和内源性线粒体途径诱导细胞凋亡;在特定条件下，p53还能通过非转录依赖性机制促进细胞凋亡［20］。而激活Akt通路能增强MDM2对p53活性的抑制能力，通过影响p53家族活性而发挥抗凋亡作用［17，20］。本研究发现，在人胃癌细胞中，过表达外源性periostin可致Akt通路活化，而Akt特异性抑制剂MK-2206可部分逆转periostin抑制化疗药物诱导的p53表达上调和肿瘤细胞凋亡的作用，证实Akt为p53的上游调控因子。

Periostin与Akt通路的相关性在其他细胞背景中亦有报道，如periostin可通过Akt通路诱导胆管癌细胞侵袭［21］、参与急性心肌梗死时活化成纤维细胞的募集以促进修复［22］等;在颈动脉损伤时以及体外培养的血管平滑肌细胞中，periostin表达上调系由PI3K/Akt依赖性通路所介导，进而促进血管平滑肌细胞迁移［23］。综合上述研究发现以及本研究结果，periostin多种生物学功能的发挥与Akt通路有关，通过激活Akt通路抑制p53表达可能是periostin过表达诱导人胃癌细胞化疗耐药性的机制之一，有望作为胃癌治疗的潜在靶点。

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