三维荧光光谱法测定红酒中白藜芦醇的含量

刘佳欣，文 震，涂志红，何 静，王春梅

（深圳大学化学与化工学院食品科学与工程系，广东深圳518060）

白黎芦醇（Resveratrol，Res）是一种二苯乙烯类化合物，化学名为3，4’，5-三羟基二苯乙烯（3，4’，5-trihydroxystilbene）（见图1）。白藜芦醇具有抗氧化、抗菌消炎、调节血脂、抑制肿瘤的作用，在健康食品的研究与开发中具有良好的应用前景[1-2]。白藜芦醇主要存在于葡萄、虎杖、藜芦、决明子和花生等天然植物及其加工制品中，尤其在红葡萄酒中含量较高[3-4]。近年来，白藜芦醇已成为红酒质量标准之一，快速、灵敏、准确地检测红酒中白黎芦醇含量，对红酒生产工艺、保存条件的控制和营养评价具有重要意义[5-6]。目前白藜芦醇的分析方法主要有紫外分光光度法、荧光分光光度法、HPLC法、RP-HPLC法、GC法等[7]。紫外分光光度法操作简单，但干扰明显，误差大[8]。HPLC法结果准确，但步骤繁琐、耗时长[9]。GC法需对样品进行衍生化处理，前处理比较复杂[10]。荧光分光光度分析白藜芦醇具有操作简便、快速、结果精确的特点[11]，但传统的二维荧光光谱并不能完整描述物质的荧光特性[12]。三维荧光光谱能够获得物质在激发波长和发射波长同时改变的情况下的荧光强度，较完整表达研究物质的光谱信息[13]。作为一种新型荧光分析技术，三维荧光光谱法应用于白藜芦醇分析尚未见报道。本文研究了白藜芦醇的三维荧光光谱特性，并以此检测红酒中白藜芦醇的含量，样品不需前处理，方法操作简便、灵敏度高、选择性好、且不破坏样品，为红酒中白藜芦醇的直接与快速分析提供了一种新方法。

图1 白藜芦醇分子式与结构Fig.1 Molecular formula and structure of resveratrol

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白藜芦醇对照品 纯度＞99%，德国Sigma公司；无水乙醇 优级纯，广州化学试剂厂；对照红酒 深圳市食品科技协会提供；红酒样品 市售。

RF-5000型荧光光谱仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇标准溶液 取白藜芦醇对照品100mg，用无水乙醇配制成0.1mg/mL溶液，储于棕色容量瓶中备用。分别移取白藜芦醇储备溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL置于6个25mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，其中白藜芦醇的浓度为0～2mg/L。摇匀，静置30min，待测。

1.2.2 红酒样品溶液的配制 取市售干红葡萄酒样品1mL，用无水乙醇稀释10倍，待用摇匀，静置40min，待测。

1.2.3 样品光谱特性 将白藜芦醇标准溶液与红酒待测液置于比色皿中，放置在荧光光谱仪中测定。仪器参数设置如下：激发波长（λex）为250～350nm，每间隔3nm读取一个数据；发射波长（λem）为300～500nm，每间隔3nm读取一个数据。激发和发射的狭缝宽度均为5nm，扫描速度为1200nm·min-1，PMT电压为700V，响应时间为自动，扫描光谱进行仪器自动校正。绘制三维填充荧光光谱图，研究白藜芦醇及红酒的三维荧光光谱特性，确定最大激发波长与发射波长。

1.2.4 样品测定 在最大激发波长与发射波长处分别测定白藜芦醇对照品与红酒样品的荧光强度，以荧光强度对相应的浓度作图，绘制标准工作曲线，计算红酒中白藜芦醇的含量。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇荧光特征

对白藜芦醇对照品与对照红酒的激发与发射光谱进行扫描，将荧光强度的数据用矩阵形式表示，行和列分别对应不同的激发光波长λex和发射光波长λem，每个矩阵元素表示在波长为λex的激发光激发下发射波长为λem的荧光强度，建立激发-发射矩阵，绘制等角三维投影荧光光谱图，结果如图2与图3所示。

图2 白藜芦醇等角三维投影荧光光谱图Fig.2 Isometric three-dimensional fluorescence spectrometry projection of resveratrol

图3 对照红酒等角三维投影荧光光谱图Fig.3 Isometric three-dimensional fluorescence spectrometry projection of reference red wine

传统的荧光光谱只是在一定激发或发射波长下进行扫描，得到激发或发射波长与荧光强度的二维谱图，但是实际上物质产生的荧光是激发光和发射光共同作用的结果，因此传统的二维荧光光谱并不能完整地描述物质的荧光特性[12]。三维荧光描述了荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系，因此能完整地描述白藜芦醇的荧光特征，并能提高对其有效荧光信息的确认与提取[14]。白藜芦醇是非黄酮多酚类化合物（见图1），其分子结构含有共轭双键体系，呈刚性平面结构，吸光后产生π→π1*跃迁，显示明显的荧光特性。苯环上的酚羟基是给电子取代基，共享了共轭π电子结构，同时扩大了白藜芦醇分子骨架的共轭双键体系，提高了荧光效率。同时酚羟基助色团的存在，使得荧光光谱的波长向长波方向移动。荧光光谱扫描表明，白藜芦醇具有单一的荧光特征发射峰，最大激发波长在290nm处，最大发射波长为380nm。而红酒由于结构复杂，有多个荧光特征发射峰，但在λex（290nm）与λem（380nm）处，其特征发射峰周围无其他荧光峰干扰，避免了物质间荧光谱的混叠现象，这说明红酒中的白藜芦醇三维荧光光谱具有指纹特性，在红酒这一多组分的混合体系分析中发挥了优势，为白藜芦醇的定性与定量分析提供了依据。

2.2 标准曲线及方法检出限

分别测定浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/L的白藜芦醇标准溶液在λex（290nm）与λem（380nm）处的荧光强度，对荧光强度/浓度进行线性拟合。在0～2.0mg/L的范围内白藜芦醇浓度与荧光强度呈现良好的线性相关性，线性回归方程为Y=2472.9X+290.34，相关系数R2=0.9984。

根据IUPAC检出限定义式，平行测定11次空白液的荧光强度。经检出限3σ/N计算，三维荧光法测定的白藜芦醇检出限为2.57×10-6mg/L，表明该方法具有较好的灵敏度。

2.3 样品测定及回收率实验

按上述所设条件和实验方法，对红葡萄酒样品溶液平行测定3次，结果见表1。

在红酒样品溶液中加入白藜芦醇标样，测定加标样品的荧光强度，并利用线性回归方程得出加标后溶液浓度，计算样品的加标回收率与相对标准偏差（RSD）。表2结果表明，样品测定的加标回收率在95.18%～100.76%之间，RSD为2.96%，表明方法准确度高，精密度好，检测结果可靠。

表1 对照红酒中白藜芦醇含量的测定结果Table 1 The contents of resveratrol in reference red wine

表2 红酒样品加标回收率Table 2 Recoveries of resveratrol in red wine

2.4 市售红酒样品中白藜芦醇含量测定

按所建方法分析市售的编号为1～6的干红葡萄酒与7～10的红葡萄酒，分析结果见表3。

表3 市售红酒中白藜芦醇含量Table 3 The contents of resveratrol in commercial red wine

由于各葡萄酒厂选用的葡萄原料的品种、生长地以及成熟季节存在差异，加上酿造工艺和保存条件的不同，所以即使是同一类型的葡萄酒其中的白藜芦醇含量也不尽相同[5]。结果显示，干红葡萄酒的白藜芦醇含量明显高于红葡萄酒，干红中白藜芦醇含量一般在0.5～2mg/L之间，部分干红与葡萄酒白藜芦醇含量较低，甚至不能检出白藜芦醇的存在。这表明，将白藜芦醇作为红酒的质量指标是可行的，三维荧光分析方法为实时监测红酒的生产和存储提供了一种准确、迅速且低成本的方法。

3 结论

3.1 获取了白藜芦醇对照品与红酒的较为完整的三维荧光光谱，确定白藜芦醇的最大激发波长λex为290nm、发射波长λem为380nm。在此λex/λem处，红酒显示明确的荧光特征峰，为快速测定红酒中白藜芦醇的含量创造了条件。

3.2 利用三维荧光光谱测定红酒中白藜芦醇，线性回归方程为Y=2472.9X+290.84，相关系数R2=0.9984，检出限为2.57×10-6mg/L，样品的加标回收率在95.18%～100.76%之间。方法操作简单，灵敏度高，精密度好，检测结果准确可靠，可广泛应用于各系列红酒中白藜芦醇的快速检测与质量控制中。

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