苹果树枝和叶中根皮苷及根皮素含量变化研究

赵艳敏，王皎，宋光明，宋新波，刘岱琳，*，谢文利

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.中国人民武装警察部队后勤学院，天津 300162）

以往对于苹果树枝和叶中根皮苷和根皮素含量的报道都是静态资料而对其动态研究尚较缺乏。本实验主要探讨了一年中生长旺盛期富士苹果果树树枝和叶中根皮素和根皮苷含量动态变化，以期为苹果枝和叶的综合利用开发提供参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

苹果树枝和叶，采自天津市尖峰天然产物研究开发有限公司苹果试验田。供试样品为三年生富士苹果果树，采用随机取样的方选取并确定了生长质地充实且无虫害苹果果树三株作为试验原料提供植株。自2011年5月初开始采样分析，以后每隔30天进行一次，在树冠4个方向均匀采取4条发育枝，该树枝及其树枝上的叶即为供试样品。

根皮苷标准品和根皮素标准品（含量均为98%）：购自天津市科曼思特医药科技发展有限公司；分析甲醇、色谱甲醇、乙腈（色谱级）、冰醋酸（分析级）、哇哈哈纯净水。

1.1.2 仪器与设备

LC－20AT型高效液相色谱仪（自配SPD－M20A型紫外检测器、CTO－20柱温箱）：日本岛津公司；FA1204B型电子天平；EYEL4型旋转蒸发仪：购自上海爱朗公司。

1.2 方法

1.2.1 标准品储备溶液的配制

准确称取根皮苷标准品20.88 mg和根皮素标准品2.80 mg，用甲醇定溶于，20 mL的棕色容量瓶中，充分摇匀，得到根皮苷、根皮素质量浓度分别为1.044mg/mL和0.140 mg/mL的混和标准品溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

1.2.2 色谱分析条件

色谱柱为phenomenexLuna C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温 30℃，检测波长 280 nm，流动相A：冰醋酸∶水=1∶99；B相：乙腈∶水∶冰醋酸=70∶29.8∶0.2，梯度洗脱程序：0～20 min B由0%升到15%，20 min～60 min B 由 15%升到 25%，60 min～85 min B由25%升到60%，85 min～90 min B由60%降至0%；进样体积 20 μL。

1.2.3 样品处理

将所摘取的新鲜苹果树枝、叶分别剪切成约0.5 cm厚度的小块和1 cm2大小的片状。分别称取50 g供试品原料，放入1 000 mL圆底烧瓶中，加入甲醇500 mL，于90℃回流提取30 min，用布氏漏斗过滤后即得粗提液，减压浓缩至干。精密称取25 mg干燥粉末至10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液备用。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

精密吸取标准品溶液1.25、2.5、5、7.5mL置于 10mL容量瓶中甲醇定容至刻度，摇匀，取新配置的四种标准溶液及标准品储备溶液各20 μL进样，按上述色谱条件测定峰面积，以标准品质量浓度X/（mg/mL）为横坐标、标准品峰面积Y/mV为纵坐标，绘制标准溶液曲线，得标准品线性回归方程见表1。

表1 混标的回归方程及线性范围Table 1 Linear equation and linear rang of mixture standard

2.2 精密度实验

精密吸取混合对照品溶液（根皮苷1.044 mg/mL，根皮素0.14 mg/mL）20 μL重复进样5次，测定各标准峰面积，计算RSD值，结果：根皮苷0.77%、根皮素0.70%。试验结果表明，在该条件下精密度良好。

2.3 稳定性实验

取同一批供试品原料，按1.2.3项下制备测试样品，按照 2.1 项下方法分别在 0、2、4、6、8、12 h 测定样品中根皮苷和根皮素的含量。测得根皮苷和根皮素的峰面积，计算RSD值，结果显示根皮苷的RSD为1.39%、根皮素的RSD值为0.81%。说明供试品溶液在12 h内稳定性很好。

2.4 重复性实验

精密称取同一月份苹果叶样品粉末5份，按1.2.3项下制备方法制得待测溶液，依照2.1项下样品测定方法测定根皮苷和根皮素的峰面积，计算RSD值。根皮苷RSD值为1.85%，根皮素的RSD值为1.99%。试验结果表明根皮苷和根皮素的含量测定结果重现性较好。

2.5 加样回收率实验

分别精密称取5 mg的八月份树叶9份于5 mL容量瓶中，取上述混合标准溶液依次加1、2、3 mL于每三份样品中，定容至5 mL，按样品的测定方法处理及测定。根皮苷的加标回收率在104.4%～109.1%之间，平均回收率为106.88%，RSD为1.80%。根皮素的加标回收率在102.1%～109.6%之间，平均回收率为106.05%，RSD为2.64%。因此，该色谱分析方法适合于苹果树枝和叶中根皮苷和根皮素的分析测定，结果准确可靠。

2.6 样品分析

2.6.1 色谱分离效果

标准品根皮苷和根皮素的液相色谱图见图1。

图1 标准品根皮苷和根皮素的液相色谱图Fig.1 HPLC of Phlordzin and Phloretin

按照上述色谱条件，将不同月份的树枝、树叶各样品进样20 μL进行液相色谱分析，所得样品色谱图见图2。

图2 苹果树枝和树叶的液相色谱图Fig.2 HPLC of apple branches and leave

与标准色谱图1比较，可确定峰1为根皮苷峰2为根皮素，峰1和2与前后相邻两峰之间的分离度均大于1.5，说明该梯度洗脱方法可以成功的分离根皮苷、根皮素和其他组分。

2.6.2 矮化密植苹果树叶中根皮苷、根皮素的含量变化根据上述色谱条件测定三年生苹果树叶5月～11月份根皮苷和根皮素的含量（表2）。

表2 苹果树叶中不同月份根皮苷和根皮素含量变化Table 2 Change of phlordzin and phloretin content in apple tree leave at different months

表2结果显示，在5月～10月期间随着叶子的生长发育根皮苷含量大体成增长趋势，随着叶子的不断老化，11月份根皮苷含量又呈现了明显的下降趋势，5月～11月份根皮苷的平均含量为16.31 mg/g。根皮素在5月含量为最高值2.541 mg/g，6月～8月含量不断降低，降幅达0.900 mg/g，继9月含量的小幅上涨后，10月～11月又有明显的下降直至最低点0.450 mg/g。

2.6.3 矮化密植苹果树枝中根皮苷的含量变化

根据上述色谱条件测定三年生苹果树枝5月～11月份根皮苷的含量（表3）。

表3 苹果树枝中不同月份根皮苷含量变化Table 3 Change of phlordzin content in apple tree branches at different months

表3结果表明，苹果树枝中的根皮苷含量在5月～11月波动较大，平均含量为11.93 mg/g。在5月～7月随着枝的发育呈现小幅的增长，而后出现了明显的下降至九月的最低含量8.32 mg/g，10月～11月的含量又有了大幅增长，其增幅高达2.8 mg/g。但在苹果树枝中未检出根皮素。

3 结论

本文研究表明，在一年中的生长旺盛期的苹果树枝和叶中均含有大量的根皮苷，其中树叶中根皮苷的平均含量为16.31 mg/g，树枝中根皮苷的平均含量为11.93mg/g，树叶中的根皮苷含量明显高于树枝。另外，仅在树叶中检出含有较多的根皮素，平均含量为1.38mg/g，而树枝中未检出根皮素。

4 讨论

1）有学说认为根皮苷是营养物质的一种储藏形式，而枝的韧皮部是根皮苷产生或存在的主要部位[12]。本文关于苹果树枝中根皮苷的含量变化规律测定结果进一步印证了这一学说。在5月份～7月份随着各器官的生长发育，根皮苷含量呈增长趋势；8月份～9月份各器官对能量的需求呈现入不敷出的状况，此时需要对以储藏形式存在的根皮苷进行酶解提供能量，使得根皮苷含量下降；10月份～11月份各器官发育停滞或衰败，使得根皮苷又得以储藏含量有所上升。

2）本实验中测得的树枝、树叶中根皮苷的含量变化规律与刘和等[9]的研究报道有较多不同，其原因可能是由于苹果树的种类、种植方式、生长年限、气候和土壤等差异造成的。

3）本研究对苹果树叶、枝中根皮苷和根皮素含量的动态变化规律进行分析，这为苹果树枝、叶的开发利用提供了有利参考。另外，对苹果树的栽培和修剪有重大意义。

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