贮存温度对原料羊乳中微生物的影响

李龙柱，李文峰，马婷婷，张富新，苏伟丽，赵见军，乌 素，艾 对，常 盈，刘 玲

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

乳是人类膳食中营养成分最完全、最易消化吸收的食品，营养学家将之称为“白色血液”和“最接近完善的食品”[1-3]。然而，乳也极易被微生物污染，是微生物生长繁殖的天然培养基[4-6]。在原料乳生产中，挤奶环境和贮存温度对乳中微生物有较大的影响，尤其是在原料乳贮存期间，微生物持续生长繁殖，易引起乳的卫生质量下降[1，4-6]。从卫生角度来看，原料乳中的微生物大致可分为大肠菌群、嗜冷菌、嗜热菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌。目前，人类利用的乳类主要以牛乳为主，在原料乳生产中，牛乳大多采用机器挤奶并立即冷却后，利用机械制冷低温贮存[1，7-8]，有效地抑制了牛乳在贮存过程中微生物的生长及繁殖。羊乳的化学组成与牛乳相似，富含多种人体必需氨基酸，脂肪球体积小，且乳糖含量更最接近人乳，易于消化吸收，也是世界上公认的最接近人乳的乳源[7-9]。但由于奶山羊养殖规模与奶牛相比较小而且饲养较为分散，机器挤奶设备及冷链贮存与运输系统还不十分完善，故原料羊乳中微生物污染更为严重，对其加工产品质量造成较为严重的影响。国内外原料羊乳的贮存大多用机械制冷贮奶仓[7-9]，有效地提高了原料羊乳贮藏期间的卫生质量，但是，不同的贮存温度和贮存时间会造成原料羊乳及其乳制品品质有较大的差别。目前，在有关原料羊乳在贮存过程中微生物的研究未见报道。因此，本文对原料羊乳在不同贮存温度下菌落总数、大肠菌群、嗜冷菌、嗜热菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌的变化进行了较为系统的研究，为进一步提高原料羊乳的卫生质量奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊乳 采自陕西某乳品企业3个奶山羊养殖小区，每个养殖小区选取10只奶山羊，取样后立即放置于温度为4℃的冰壶中，2h内送到实验室进行处理；平板琼脂计数培养基[5-9]用于羊乳中菌落总数和嗜热菌的测定；结晶紫中性红胆盐琼脂培养基 用于羊乳中大肠菌群的测定；CVT培养基 用于羊乳嗜冷菌的测定；三丁酸甘油酯琼脂培养基 用于羊乳中脂肪分解菌的测定；改良乳平板计数琼脂培养基[5]用于羊乳中蛋白分解菌的测定。

JND-50型恒温冷藏箱 宁波江南仪器厂；QL-866型小型漩涡振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限责任公司；移液枪（100～1000μL和10～100μL）德国艾本德股份有限公司；XK97-A型菌落计数器 姜堰市新康医疗器械有限责任公司；SPX-250B-Z型生化培养箱、YXQ-LS-100A-17型立式压力蒸汽灭菌锅、GZX-9146MBE型数显鼓风干燥箱、HHS21-4-45型数显式电热水浴锅 上海博迅实业有限责任公司；JY301型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；PE-20-43型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限责任公司；MDF-U5411型低温冰箱 日本三洋电机公司；HYC-260-66-1型生物试剂柜 Haier有限责任公司；BSC-1300-II-A56型生物安全柜 苏州尚田洁净技术有限责任公司；UPT-1-40-L-32型优普UPT系列超纯水器 成都超纯科技有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 测定方法 羊乳中菌落总数的测定：按GB 4789.2-2010[11-13]中菌落总数的测定方法，36℃培养48h，之后进行计数，结果以cfu/mL表示。

大肠菌群的测定：按GB 4789.3-2010[14-15]中大肠菌群的测定方法，36℃培养24h，之后进行计数，结果以cfu/mL表示。

嗜冷菌的测定：按纪振杰等[10]方法中嗜冷菌的测定方法，21℃培养18～25h，之后进行计数，结果以cfu/mL表示。

嗜热菌的测定：按Villar[5]、D’amico[6]、Fook等[8]方法中嗜热菌的测定方法，乳样样品需要在62.8℃条件下处理30min，30℃培养72h，之后进行计数，结果以cfu/mL表示。

蛋白分解菌和脂肪分解菌的测定：分别按Villar[5]、D’amico[6]、Fook等[8]方法中蛋白分解菌和脂肪分解菌的测定方法，30℃培养72h，之后进行计数，结果以cfu/mL表示。

1.2.2 贮存方法 在各个选取的养殖小区内，先用毛巾蘸取40℃左右的热水擦拭奶山羊乳房，并用另一条毛巾擦干，手工挤奶弃去前三把乳之后，直接将需要的乳样装入灭过菌的取样管中，并迅速放入冰壶中；1h后带回实验室，在无菌操作台中将冷却后的乳样分装入提前灭过菌并干燥的试管中，分别在3、10、25、37℃下贮存0、6、12、18、24、30、36h，测定菌落总数、大肠菌群、嗜冷菌、嗜热菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌。

2 结果与分析

2.1 贮存温度对羊乳中菌落总数的影响

菌落总数（Total bacterial count）是乳被微生物污染的总体情况，是反映原料乳卫生质量的一项重要指标[5-8，16-18]。

图1 贮存温度对羊乳中菌落总数的影响Fig.1 Influence of storage temperature on the total bacterial count

由图1可以看出，羊乳在贮存过程中，乳中菌落总数随贮存时间的延长有逐渐增大的趋势，但不同贮存温度下菌落总数变化速度有较大差异。羊乳分别在37、25℃下贮存4、6h时，羊乳中菌落总数已达到国标GB 19301-2010[4]中所规定收购生鲜乳的微生物指标（2×106cfu/mL），贮存6、18h后，菌落总数迅速上升，显著高于10℃和3℃下的菌落总数（p＜0.05）。而在10℃和3℃贮存羊乳36h，菌落总数变化速度差异不大（p＞0.05）。由此可见，羊奶37、25℃下贮存时间分别不能超过4、6h，而在10℃和3℃下可贮存36h。羊乳中菌落总数在不同贮存温度下都能保持一定的时间不变，其原因是生鲜乳中含有多种抗菌性物质，对乳中的微生物具有杀菌或抑制作用，生鲜乳在不同的贮存温度下都有短暂的抑菌期，在抑菌期内，乳中的菌落总数不会增加[17-23]。原料羊乳如果贮存得当菌落总数变化速度较慢，但是如果贮存温度过高或者贮存时间过长就会引起菌落总数的急剧上升，因此在榨乳后应该立即冷却，进行低温短时贮存。

2.2 贮存温度对羊乳中大肠菌群的影响

大肠菌群（Coliform）能从总体上反映出奶山羊在挤奶过程中乳汁被粪便和肠道菌污染的程度[16-19]。

由图2可以看出，在羊乳贮存过程中，羊乳中大肠菌群数随贮存时间的延长逐渐增大，但不同温度下大肠菌群数变化速度有较大差异。原料羊乳在37℃下贮存6h后，大肠菌群数迅速上升，明显高于其他贮存温度下的大肠菌群数（p＜0.05）；在25℃和10℃下贮存12h后，大肠菌群数迅速上升；而在3℃下贮存36h，大肠菌群数变化差异不显著（p＞0.05）。由此可见随着贮存温度的升高，大肠菌群生长繁殖速度加快，这是因为羊乳中的大肠菌群的最适宜生长繁殖温度是35℃[17-23]。大肠菌群数量越高，表明原料羊乳被粪便和肠道菌污染的程度的越大，在挤奶过程和贮存过程中应该加强卫生管理[19-23]。原料羊乳如果贮存得当，其大肠菌群数量变化速度较小，但是如果贮存温度过高或者贮存时间过长都会引起大肠菌群数量的激增，因此在榨乳后应该尽量避免污染且低温短时贮存。

图2 贮存温度对原料羊乳中大肠菌群的影响Fig.2 Influence of storage temperature on the coliform

2.3 贮存温度对羊乳中嗜冷菌的影响

嗜冷菌（Psychrophic bacteria）是指能在较低温度下生长繁殖的一类微生物的总称，主要包括耶氏菌、李斯特菌和假单胞菌等[10，24-30]。嗜冷菌能够反映出原料乳在低温贮存期间及冷链运输过程中被嗜冷微生物污染以及其繁殖生长的情况。如果原料羊乳在贮存和运输过程中嗜冷菌急剧生长繁殖，则会给乳制品加工中的预巴杀和巴氏杀菌工艺带来严重产品质量缺陷，因为原料羊乳中的嗜冷菌会产生大量的耐热性的酶，如果巴氏杀菌温度过高虽然可以让这些酶类失活但也会造成羊乳热不稳定性，进而产生挂壁和絮状沉淀，而且也可能使羊乳中芽孢激活[24-34]；如果巴氏杀菌温度过低虽然能保证羊乳不变质，但是却不能使这些酶类失活，这将会让羊乳乳制品在贮藏和运输过程产生膻味和不能接受的滋气味，并导致羊乳乳制品货架期缩短。

从图3中可以看出，贮存温度对原料羊乳中的嗜冷菌有较大的影响，羊乳中嗜冷菌数随贮存时间的延长而逐渐增大，但不同温度下嗜冷菌数变化速度有较大差异。在低温下贮存，贮存温度越低和贮存时间越长时，羊乳中嗜冷菌数量变化速度越快。根据黄艾祥等[23]的研究，当原料乳中嗜冷菌数量超过1×103cfu/mL时，会显著影响其液态乳制品的品质。羊乳在10℃和3℃下贮存，前12h嗜冷菌数量保持稳定；12h以后，羊乳中嗜冷菌数迅速上升，显著高于其他贮存温度下的嗜冷菌数（p＜0.05），在12h时其数量分别达到6×105cfu/mL和4.5×105cfu/mL，显著高于1×103cfu/mL；嗜冷菌在贮存和运输过程中开始时基本维持不变，温度越接近最适生长温度7℃时增加越快，原因可能是嗜冷菌先经历一个延迟期，适应环境后开始繁殖，更适合在低温的环境中生长[24-35]。羊乳在37℃和25℃下贮存时，其嗜冷菌数量在前12h时变化不大（p＞0.05），贮存12h以后，嗜冷菌数量逐渐增大，尤其是在贮存18h时，羊乳中嗜冷菌数量分别达到1.53×105cfu/mL和2.3×105cfu/mL，已经高于1×103cfu/mL这一数值（p＜0.05）。由此可见，低温较适合嗜冷菌生长，而高温可抑制嗜冷菌的生长；低温长时间贮存和运输不利于控制原料羊乳中的嗜冷菌数量的变化。

图3 贮存温度对原料羊乳中嗜冷菌的影响Fig.3 Influence of storage temperature on the psychrophilic bacteria

2.4 贮存温度对羊乳中嗜热菌的影响

嗜热菌（Thermophilic bacteria）是一类能在较高温度下残存的微生物，主要包括各种芽孢和芽孢杆菌[5-8，20-23]等，它反映乳在热处理过程中嗜热微生物生长繁殖情况。

图4 贮存温度对原料羊乳中嗜热菌的影响Fig.4 Influence of storage temperature on the thermophilic bacteria

从图4可以看出，原料羊乳中嗜热菌数随贮存时间的延长逐渐增大，但不同温度下嗜热菌数变化速度有较大差异。羊乳在37℃和25℃下贮存0～6h期间，嗜热菌数迅速上升，明显高于10℃和3℃下的嗜热菌数量（p＜0.05）。而原料羊乳3℃下贮存36h，嗜热菌数量变化速度差异不大（p＞0.05）。根据黄艾祥等[23]的研究，当原料羊乳中嗜热菌超过10～102cfu/mL，会显著影响其液态乳制品的货架期。在37℃下贮存6h时，原料羊乳中嗜热菌数量已达到1.22×103cfu/mL，显著超过10～102cfu/mL这一数值。随着贮存期延长嗜热菌数量有所增加，而通常嗜热菌大多为耐热芽孢菌，具有极强的耐热性，即使高温处理后，仍然可能会残存[5，20-23]。由此可见，较高贮存温度是影响原料羊乳中嗜热菌生长和繁殖的一个重要因素，所以要避免其在高温下贮存过长时间。

2.5 贮存温度对羊乳中蛋白分解菌的影响

蛋白分解菌（Proteolytic bacteria）是一类能分解乳蛋白的嗜中温细菌[5-8，23]，对乳及乳制品的滋气味、口感以及货架期等有重要影响。蛋白分解菌所分泌的蛋白酶能将原料羊乳中蛋白质分解为多肽类和氨基酸[5-8]，这将会引起乳制品的不良滋气味，进而影响乳制品的货架期[35-37]。

图5 不同贮存温度对原料羊乳中蛋白分解菌的影响Fig.5 Influence of storage temperature on the proteolytic bacteria

从图5可以看出，原料羊乳中蛋白分解菌数随贮存时间的延长而逐渐增大，但不同温度下蛋白分解菌数变化速度有较大差异。原料羊乳在37℃和25℃下贮存，羊乳中蛋白分解菌数量迅速上升，明显高于10℃和3℃下的蛋白分解菌数量（p＜0.05）。而原料羊乳在3℃、10℃下贮存36h，蛋白分解菌变化速度差异不显著（p＞0.05）。由此可见，羊乳在10℃和3℃下短时贮存，可有效抑制其中蛋白分解菌的生长和繁殖。其原因主要是在低温下贮存时，一般适宜于嗜中温条件下繁殖的微生物[24-30]，在低温环境生长处于抑制状态，即属于低温类的微生物虽然能够繁殖，但是其生长和繁殖速度非常缓慢，因此在低温下贮存一段时间，嗜中温微生物基本稳定[31-36]，因此低温贮存是保证原料羊乳卫生质量的重要保证。

2.6 贮存温度对羊乳中脂肪分解菌的影响

脂肪分解菌（Lipolytic bacteria）是一类能分解乳中脂肪的嗜中温细菌[5-8]，对乳及乳制品的风味有重要的影响。

从图6可以看出，原料羊乳中脂肪分解菌数随贮存时间的延长而增大，但不同温度下脂肪分解菌数变化速度有较大的差异。原料羊乳分别在37℃下贮存6h、25℃下12h以后，原料羊乳中的脂肪分解菌数迅速上升，36h时分别达到5.2×106cfu/mL和7.8×106cfu/mL，明显高于10℃和3℃下贮存时的脂肪分解菌数量（p＜0.05）。由此可见，贮存温度和时间是影响原料羊乳脂肪分解菌数量的重要因素；在低温（10℃和3℃）和短时间（6h）贮存时，可有效抑制其中脂肪分解菌的生长和繁殖。原料羊乳在高温和长时间下贮存时脂肪分解菌会对羊乳中乳脂肪有降解作用[29-30]，导致原料乳脂肪球膜破裂，造成乳脂肪球上浮，同时使游离脂肪酸浓度升高，增加羊乳和羊乳乳制品的膻味[37-41]。

图6 不同贮存温度对原料羊乳中脂肪分解菌的影响Fig.6 Influence of storage temperature on the lipolytic bacteria

3 结论

本文对不同贮存温度下原料羊乳中微生物变化规律进行了研究，实验结果表明：

3.1 原料羊乳在3℃下贮存36h，乳样中菌落总数、大肠菌群、嗜热菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌变化不显著，嗜冷菌变化差异显著。

3.2 在10℃下贮存24h后，乳样中菌落总数、大肠菌群、嗜冷菌变化差异显著，嗜热菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌变化不显著。

3.3 当贮存温度为37℃和25℃时，分别贮存6h和12h以后乳样中的菌落总数、大肠菌群、嗜热菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌变化差异显著，而嗜冷菌变化差异不显著。随着贮存温度的升高和贮存时间的延长，原料羊乳中微生物数量增加。

在原料羊乳的贮存和运输过程中，应尽可能将贮存温度控制在3℃，贮存时间不应该超过36h，以提高原料羊乳的卫生质量，为生产优质的羊乳乳制品奠定基础。

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