环糊精抑制脂肪氧合酶活性的影响因素探究

王金鹏，李奕璇，任琴琴，金征宇

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡214122)

大豆脂肪氧合酶能够催化多不饱和脂肪酸解产生醛、酮等氧化产物，给食品的风味、口感等带来不良的影响。目前最常用的去除大豆脂肪氧合酶活性的方法就是加热钝酶法［1］，但这将导致蛋白质溶出率偏低、蛋白功能特性降低、产生不良风味、大豆蛋白溶解度下降，降低食品营养价值等问题［2］。另有相关报道采用环糊精抑制脂肪氧合酶催化过程，如Estrella等［3］研究了环糊精能包埋外源底物从而使其的氧化反应受到抑制;Roque Bru［4］研究发现，环糊精的加入使酶催化反应的速率降低。但是这些报道普遍认为环糊精空腔包埋了底物亚油酸分子，从而致使酶催化氧化受抑制，但从环糊精－酶超分子体系来看，环糊精能直接与相关酶发生作用［5］。例如Punpeng等人［6］发现环糊精抑制α－淀粉酶分子对生淀粉的降解消化能力，于博等人发现β－环糊精能够竞争性的抑制普鲁兰酶的催化活性［7］。因此本文提出假设——环糊精能够直接抑制脂肪氧合酶的活性，在假设基础上研究影响环糊精抑制LOX酶活的因素，这对于揭开环糊精抑制脂肪氧合酶催化的影响机制、明确环糊精在脂肪氧合酶催化氧化反应中的作用提供了重要的依据，为环糊精与某些催化酶类相互作用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

β－ CD、H3BO3、Na2B4O7·10H2O、吐温 －20、NaOH、HCL、无水乙醇 均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司;脂肪氧合酶(LOX－1，EC，Type I－S，46000U/mg)、亚油酸(LA，纯度≥98%)均购于Sigma－Aldrich(上海)贸易有限公司。

电子天平 梅特勒－托利多仪器有限公司;Delta320pH计 梅特勒－托利多仪器有限公司;移液枪 BeyonLab Scientific Instrument(上海);TU－1900双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪氧合酶活性的测定 采用分光光度法对脂肪氧合酶的活性进行测定，具体步骤如下:在25℃，pH为9.0条件下，以亚油酸为底物的3mL反应体系在234nm处每分钟增加0.001吸光度值定义为一个酶活单位。取500μL酶液移入2.5mL的底物溶液中，混匀后于25℃水浴中恒温4min，用5mL无水乙醇终止反应，混匀后测定反应液在234nm处的吸光度。空白样为0.5mL酶液中加入5mL无水乙醇，再加入2.5mL底物溶液，于25℃水浴恒温4min。

1.2.2 环糊精抑制脂肪氧合酶活性的验证实验 酶反应在25℃，通过改变环糊精、酶液和亚油酸三者的添加顺序来进行验证:

a.取500μL酶液于试管中，加入1.44mL缓冲液，然后加入1mL环糊精溶液，充分混匀，反应4min后，再加入60μL亚油酸，混匀，反应4min后，加入5mL无水乙醇终止反应。于234nm处1cm光程的石英比色皿中测吸光度。

b.取1mL环糊精于试管中，加入1.44mL缓冲液，再加入60μL亚油酸，充分混合，4min后加入500μL酶液，4min后加入5mL无水乙醇终止反应。于234nm处测吸光度。

c.将1mL环糊精、1.44mL缓冲液、500μL酶液和60μL亚油酸同时加入试管，反应8min后终止。于234nm处测吸光度。

d.不加环糊精，取500μL酶液，加入2.44mL缓冲溶液，混匀，加入60μL亚油酸，反应8min后，加入5mL无水乙醇，终止反应。于234nm处测吸光度。

1.2.3 环糊精抑制脂肪氧合酶活性的单因素实验

环糊精抑制脂肪氧合酶催化氧化活性的实验主要受温度、pH、环糊精浓度以及Fe3+、Fe2+的浓度的影响，实验方法为:

取500μL酶液，加入1mL环糊精，1.44mL的缓冲溶液，在水浴中反应30min后，加入60μL亚油酸，反应 4min后，加入5mL无水乙醇终止反应，于234nm处测吸光度。

1.2.3.1 温度影响 pH9，环糊精浓度为10mmol/L时，不添加 Fe3+和 Fe2+，研究 5、10、15、20、25、30、35、40、45℃水浴下，环糊精对脂肪氧合酶的抑制效果的影响趋势。

1.2.3.2 pH影响 在25℃，环糊精浓度为10mmol/L时，不添加 Fe3+和 Fe2+，研究 pH4、5、6、7、8、9、10、11、12时，环糊精对脂肪氧合酶的抑制效果的影响趋势。

1.2.3.3 环糊精浓度影响 25℃下pH为9时，不添加 Fe3+和 Fe2+，研究环糊精浓度为 10、1、0.01、1 ×10－4、1 ×10－6、1 ×10－8、1 ×10－12mmol/L 时，环糊精对脂肪氧合酶的抑制效果的影响趋势。

1.2.3.4 Fe3+浓度影响 25℃下pH9，环糊精浓度为10mmol/L 时，不添加 Fe2+，研究 Fe3+浓度为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005μmol/L 时，环糊精对脂肪氧合酶的抑制效果的影响趋势。

1.2.3.5 Fe2+浓度影响 25℃下，pH9，环糊精浓度为10mmol/L 时，不添加 Fe3+，研究 Fe2+浓度为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005μmol/L 时，环糊精对脂肪氧合酶的抑制效果的影响趋势。

1.2.4 正交实验 根据单因素实验的结果，对温度、pH、环糊精浓度、Fe3+浓度和Fe2+浓度这五个因素三个水平进行L18(35)正交实验。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

利用SPSS软件(19.0英文版)对实验结果进行极差分析及方差分析，判断显著因素［8］。

1.2.5 数据分析与处理 本实验数据中紫外分析数据均为4次重复6次平行，荧光光谱和圆二色谱数据均为3次重复3次平行，使用OriginPro 8.5进行数据分析和图形绘制。

2 结果与讨论

2.1 环糊精抑制脂肪氧合酶活性的验证实验

从图1中可以看出，与对照组相比，环糊精的添加能够抑制脂肪氧合酶的活性，且添加次序造成对LOX的抑制程度也不同:先加环糊精和酶作用一段时间后再加底物的抑制率(a)最大，三者一起加入的抑制率次之(c)，而先让环糊精与底物充分作用最后加入酶溶液的抑制率最小(b)。由此可知，环糊精存在的条件下，脂肪氧合酶催化氧化亚油酸的反应受到抑制的原因，除了环糊精包合底物亚油酸之外，环糊精还能与脂肪氧合酶直接发生相互作用，并且与环糊精包合底物抑制催化反应相比，环糊精与脂肪氧合酶发生作用从而抑制反应的程度更大，占主导地位。

图1 β－CD的不同添加顺序对脂肪氧合酶的作用Fig.1 Comparison of inhibition effects of different β－cyclodextrins on the catalytic oxidation of linoleic acid by lipoxygenase in three different adding arrangements

2.2 环糊精抑制脂肪氧合酶活性的单因素实验

2.2.1 反应体系温度对环糊精抑制效果的影响 从图2中可以看出，随着温度升高，环糊精抑制脂肪氧合酶催化亚油酸氧化的作用增强，升到40℃时，氢过氧化物的含量开始明显减少。原因可能是温度升高使酶分子结构变得松散，氨基酸残基的暴露程度增大，有利于环糊精空腔与更多的疏水性氨基酸残基发生复合作用，从而抑制了脂肪氧合酶的活性。

图2 温度对环糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影响Fig.2 Effect of temperature on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

2.2.2 pH对环糊精抑制效果的影响 由图3可以看出，随着pH的升高，环糊精对脂肪氧合酶的抑制作用呈先减弱后增强的趋势，当pH9时，环糊精对脂肪氧合酶的抑制作用最弱。这可能是因为脂肪氧合酶的催化反应塑料最大时pH为9～10，随着pH的变化，酶分子活性中心基团解离程度发生变化，进而导致酶分子的活性构象发生变化［9］，该变化将影响环糊精与脂肪氧合酶的结合程度。

图3 pH对环糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影响Fig.3 Effect of pH on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

2.2.3 环糊精浓度对环糊精抑制效果的影响 由图4可以看出，随环糊精浓度的减少，环糊精对脂肪氧合酶催化氧化活性的抑制作用也在减弱，这可能是因为低浓度时，β－CD与脂肪氧合酶分子的相互作用较弱不致于引起酶分子的活性构象的变化;随着β－CD浓度的增加，能够与脂肪氧合酶分子相互作用的疏水性空腔不断增加，使得两者的相互作用增强，改变了酶分子的活性构象，从而抑制了酶的催化活性。

2.2.4 Fe3+和 Fe2+浓度对环糊精抑制效果的影响 在脂肪氧合酶中，铁以两种形态存在:Fe3+和Fe2+，其中 Fe3+是活化态，Fe2+是非活化态，Fe2+只有转变成Fe3+才具有催化活性。

Fe3+浓度和Fe2+浓度对环糊精抑制作用的影响结果如图5所示。

由图5可以看出同浓度下，Fe2+的抑制作用优于Fe3+，这可能是因为适量的外源Fe3+通过电子传递促进了脂肪氧合酶催化中心Fe2+向Fe3+的转化，促进酶促反应进行［10］。

2.3 各因素对环糊精抑制效果影响的正交实验

根据表1所设的因素水平表进行正交实验设计如表2所示，结果分析如表3所示。

图4 环糊精浓度对环糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影响Fig.4 Effect of decreasing concentrations of β－CD on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

图5 Fe3+和Fe2+对环糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影响Fig.5 Effects of decreasing concentrations of Fe3+and Fe2+on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

表2 正交实验结果Table 2 The results of five factors and three levels orthogonal experiments

方差分析结果表明，因素C高度显著，因素B显著，因素D、E、A不显著。环糊精浓度为10mmol/L，反应温度在35℃，反应 pH 为 4，Fe3+浓度0.005μmol/L，Fe2+浓度0.01μmol/L时，环糊精抑制脂肪氧合酶活性能力最高，在该实验条件下测定到的吸光值为0.118，经计算环糊精对脂肪氧合酶的抑制率达到86.26% 。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

3 结论

环糊精能够直接作用脂肪氧合酶从而抑制其活性;在环糊精浓度为10mmol/L，反应温度在35℃，反应 pH 为 4，Fe3+浓度在 0.005μmol/L，Fe2+浓度在0.01μmol/L时，环糊精抑制脂肪氧合酶活性能力最佳，抑制率达到86.26%。

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