构建酿酒酵母工程菌合成香紫苏醇

杨薇，周雍进，刘武军，沈宏伟，赵宗保,3

1中国科学院大连化学物理研究所生物技术部，辽宁 大连 116023

2营口理工学院化学工程系，辽宁 营口 115000

3中国科学院大连化学物理研究所 催化基础研究国家重点实验室，辽宁 大连 116023

萜类化合物广泛存在于植物、动物和微生物中，至今已分离出40余万种。许多萜类化合物是植物生长、发育和一般代谢必不可少的化学物质[1]。萜类化合物可应用于医药、保健品、香精、香料或农药领域[2]。然而，大多萜类化合物在其天然生产物种中的含量极低，成为制约它们规模化应用的瓶颈。近年来，合成生物学和代谢工程技术迅速发展，为改造目标分子的天然生产物种或设计异源生产途径提供了可能[3]。例如，构建微生物“细胞工厂”合成紫穗槐二烯 (青蒿素前体)[4]、紫杉烯 (红豆杉醇前体)[5]和番茄红素[6]等萜类化合物，取得了令人振奋的结果。

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的遗传背景相对清晰，遗传操作平台成熟，生物安全性好。由于其甲羟戊酸 (MVA)途径和异戊二烯(PDP)通路活性高，S.cerevisiae是构建萜类化合物异源合成途径的理想宿主之一。例如，经过途径改造的S.cerevisiae工程菌，合成 (E,E,E)-香叶基香叶醇、(E,E)-法尼醇和丹参酮生物合成前体次丹参酮二烯，产量分别达到3.31 g/L、145.7 mg/L和488 mg/L[7-10]。此外，异戊二烯合酶亚细胞定位能增加萜类化合物的合成量[11]。

香紫苏醇是一种半日花烷型二萜二叔醇，首次在南欧丹参鼠尾草 (Clary sageSalvia sclarea)中发现，常用于化妆品和香水的香料成分及食品调味材料。由于其具有很强的抗菌活性及对真菌生长和植物生长具有调节作用，香紫苏醇也可应用于农药领域。此外，香紫苏醇对人类白血病细胞[12]、结肠癌细胞[13]及异种移植物[13-14]具有细胞毒性。目前，大多以植物香紫苏花序及茎叶为原料提取香紫苏浸膏，进一步纯化得到香紫苏醇。由于香紫苏生长周期长，且受土地、环境及气候因素影响，不能满足工业生产需求。瑞典科研人员发现了香紫苏醇合成的两个关键酶，焦磷酸赖百当烯二醇酯 (LPP)合酶 (SsLPPS)和香紫苏醇合酶 (SsTPS)，分别催化香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)生成LPP及LPP生成香紫苏醇的反应[15](图1)。以大肠杆菌为宿主，重组真核生物PDP、MVA途径及香紫苏醇的生物合成途径，结合高

图1 酿酒酵母中香紫苏醇合成策略Fig.1 Schematic diagram of sclareol biosynthesis in S.cerevisiae.Each solid arrow represents one reaction step,and the dashed arrow indicates several reaction steps. Abbreviations: HMG-CoA: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A;MVA:mevalonate;IPP,isopentenyl pyrophosphate; DMAPP: dimethylallyl diphosphate;FPP:(E,E)-farnesyl diphosphate;FOH:(E,E)-farnesol; GGPP: (E,E,E)-geranylgeranyl diphosphate; GGOH: (E,E,E)-geranylgeraniol; LPP:labdenedioldiphosphate;PDP:prenyldiphosphate;HMG-R:HMG-CoA reductase(HMG1 encoded);FPS:FPP synthase(ERG20 encoded);GGPPS:GGPP synthase(BTS1 encoded);SsLPPS:LPP synthase of S.sclarea(LPPS encoded);SsTPS:terpene synthase of S.sclarea(TPS encoded).Heterologous genes(LPPS and TPS)were derived from S.sclarea and other genes were cloned from S.cerevisiae.

密度发酵技术，香紫苏醇产量达到约1.5 g/L[16]。本实验室最近采用模块化的途径工程策略，快速有效地在S.cerevisiae中组装预先设计好的人工生物合成途径[7]。本文拟利用香紫苏醇合成关键酶的生物学信息，采用模块途径工程策略，构建香紫苏醇人工生物合成途径，探讨过表达代谢关键酶、蛋白质融合及异源蛋白信号肽等因素对S.cerevisiae工程菌合成香紫苏醇的影响，为进一步设计萜类化合物高产菌株提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本文所用菌株列于表1。香紫苏醇、GOH、FOH和GGOH购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自大连宝生物公司。引物由北京鼎国昌盛生物技术公司合成。全基因合成及测序由大连宝生物公司完成。DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所。其他试剂购自当地供应商。

表1 本文所用菌株及质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 方法

1.2.1 菌株培养

S.cerevisiae在30℃、200 r/min下培养。营养缺陷型菌株筛选采用SD培养基 (2%葡萄糖，0.67%含(NH4)2SO4的酵母氮源，不添加氨基酸)。摇瓶培养采用YPD培养基 (2%葡萄糖，2%蛋白胨和1%酵母浸膏)。

E.coli在37℃、200 r/min下培养。重组菌株筛选采用LB培养基 (1%NaCl，1%胰蛋白胨，0.5%酵母浸膏，100µg/mL氨苄青霉素添)。

所有培养基均经120℃、20 min灭菌处理。

1.2.2 S.cerevisiae对香紫苏醇的耐受性分析

将S.cerevisiae菌株分别在添加了0 mg/L、30.9 mg/L、308.5 mg/L和925.5 mg/L香紫苏醇的YPD培养基中培养，通过监测细胞密度分析其生长情况。

1.2.3 全基因合成

SsLPPS和SsTPS基因序列经过密码子优化网站 (http://www.jcat.de/Start.jsp)优化，使密码子更适合在S.cerevisiae中表达。优化后的序列由大连宝生物公司合成，分别克隆到pMD19-T载体上，得到重组质粒pMD19-T-LPPS和pMD19-T-TPS。全合成的基因用测序引物pMD18-F(5′-GCCTCTTCGCTATTACGCCA-3′)和pMD18-R(5′-CACTCATTAGGCACCCCAG G-3′)进行测序验证。

1.2.4 重组质粒构建

本文所用质粒列于表1。重组质粒构建均采用模块途径工程策略的方法[7]。具体步骤为：第一步，用高保真聚合酶进行PCR(反应条件：95℃5 min；98℃ 10 s，68℃ 4 min，35个循环；68℃10 min)克隆各模块的不同DNA片段，包括启动子、功能基因、终止子和用于重组的重叠序列；第二步，通过高效的多片段融合PCR(共两轮：前一轮反应条件：95℃5 min；98℃10 s，68℃6 min，15个循环；72℃10 min；后一轮反应条件：95℃5 min；98℃10 s，68℃6 min，35个循环；72℃10 min)方法在体外将模块的不同片段融合连接[17]；第三步，利用S.cerevisiae高效地重组性能，将不同模块的DNA片段及线性化的表达载体pYX212(EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切)转化到胞内进行同源重组，并在相应营养缺陷型平板上筛选。从表型正确的克隆中提取重组质粒，进一步测序验证各模块间拼接的准确性。

1.2.5 香紫苏醇的提取与检测

将测序正确的载体分别转化S.cerevisiaeBY4741ML，得到工程菌株 S1-S6(图2)。

将S.cerevisiae工程菌株发酵醪液与等体积正己烷混和，在30℃下处理30 min。室温下在玻璃瓶离心 (1 800 r/min)处理8 min，取上层有机相，浓缩后重悬于正己烷中，待测。

香紫苏醇含量利用气相色谱 (GC7890F)系统分析。采用SE-54型毛细管色谱柱 (0.25 mm×30 m)，分析条件为：柱温250℃，进样口温度270℃，检测器温度290℃，载气流速1.6 mL/min。在此分析条件下，香紫苏醇的保留时间为8.3 min。

2 结果

2.1 S.cerevisiae的香紫苏醇耐受性

文献报道，香紫苏醇具有植物病原真菌灰葡萄孢菌Botrytis cinerea的抗菌活性[18]。为验证香紫苏醇对真菌酿酒酵母的抗菌活性，考察S.cerevisiaeBY4741ML对香紫苏醇的耐受性。与对照相比，S.cerevisiae在外加925.5 mg/L香紫苏醇的培养基中生长受到抑制，但抑制率仅为14.3%。可见，菌株耐受性应不会成为香紫苏醇异源合成途径功能体现的制约因素。

2.2 PDP通路的影响

增加前体供给是一种常用且有效的促进目标产物合成的策略。以往实验证实，过表达PDP通路的关键酶法尼基焦磷酸 (FPP)合酶(FPPS，ERG20编码)或 GGPP合酶 (GGPPS，BTS1编码)(图1)，或同时过表达上述两个酶，均有利于工程菌株产生二萜化合物次丹参酮二烯[7]。菌株S2，过表达FPPS和 GGPPS融合蛋白 (两蛋白之间用柔性连接肽GGGS连接)及过表达异源的SsLPPS和SsTPS蛋白，而对照株菌株S1仅过表达SsLPPS和SsTPS(图 2)。实验中未检测到菌株S1合成香紫苏醇 (GC检测限约0.1 mg/L)，而菌株S2香紫苏醇产量达到(2.05±0.46)mg/L。

图2 不同酿酒酵母菌株的重组质粒 (A)和香紫苏醇产量 (B)Fig.2 Recombinant plasmids(A)and sclareol production(B)of different S.cerevisiae strains.(A)Genes(arrows with white gene name):BTS1:encoding for GGPP synthase;ERG20:encoding for FPP synthase;LPPS:encoding for LPP synthase;TPS:encoding for terpene synthase;tLPPS:encoding for truncated LPP synthase;and tTPS:encoding for truncated terpene synthase;tHMG1:encoding for HMG-CoA reductase;promoters(green arrows):TPIp,TEF1p and TDH3p;terminators(red rectangles):FBA1t,TDH2t,pYX212t and TDH3t;linker peptide(yellow rectangles):glycine-glycine-glycine-serine(GGGS).Heterologous genes(LPPS,TPS,tLPPS and tTPS)were derived from S.sclarea;other genes,promoters and terminators were cloned from S.cerevisiae.(B)S.cerevisiae cells at 30℃,200 r/min for 48 h,and the culture broth was used for extraction of sclareol.Each result represents the average of three independent clones.

2.3 异源蛋白信号肽对香紫苏醇合成的影响

通过网站TargetP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和ChloroP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)对SsLPPS和SsTPS进行信号肽预测，并结合过去的实验结果[15]，推测N-末端分别含有63个氨基酸和50个氨基酸组成的信号肽。菌株S3，过表达去除信号肽的SsLPPS(tSsLPPS)和SsTPS(tSsTPS)及融合蛋白GGPPS-FPPS(图2)。实验发现，菌株S3香紫苏醇产量达到 (5.00±0.66)mg/L，是携带信号肽表达菌株S2产量的2.4倍。可见，去除异源酶的信号肽，有利于其在S.cerevisiae中发挥功能。

2.4 异源酶融合

将代谢途径中催化相邻的两个或两个以上反应的酶融合表达，可增加代谢途径通量[7,19]。进一步融合异源酶或去除信号肽的截短异源酶，以确定其对香紫苏醇合成的影响。菌株S4和S5在过表达融合蛋白GGPPS-FPPS的基础上，分别过表达融合蛋白LPPS-TPS和tLPPS-tTPS(图2)。实验发现，菌株S4香紫苏醇产量达到(6.05±0.59)mg/L，是菌株S3的1.21倍。然而，菌株S5仅获得 (0.81±0.15)mg/L香紫苏醇，明显低于菌株S3。

2.5 MVA途径对香紫苏醇合成的影响

羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMGR，HMG1编码)是MVA途径的限速酶。相对于完整的 HMGR，去除了 N-端 529 aa调控序列的HMGR(tHMGR，tHMG1编码)更有利于促进人工生物合成途径的活性[7,20]。因此，在菌株S4的基础上进一步过表达tHMGR，得到菌株S6(图2)。实验发现，菌株S6香紫苏醇产量达到(8.96±0.96)mg/L，是菌株S4的1.48倍，是当前香紫苏醇产量较高的S.cerevisiae工程菌。

3 讨论

本文以S.cerevisiaeBY4741ML为宿主，构建香紫苏醇的人工生物合成途径。共构建了6株重组菌株S1至S6，经过摇瓶发酵后，对其香紫苏醇的产量进行比较，结果如图2所示。可见，仅引入异源的香紫苏醇合成两个关键酶LPPS和TPS的菌株S1，未见香紫苏醇产生 (检测限0.1 mg/L)；然而，增加二萜化合物前体合成的PDP通路中相应关键酶，即FPPS和GGPPS，使菌株S2的香紫苏醇产量达到 (2.05±0.46)mg/L，说明前体代谢流的加强，可为人工生物合成途径提供更多前体，并且过表达融合蛋白GGPPS-FPPS更有利于代谢流流向GGPP。实验还发现，菌株S1中可检测到 (0.08±0.02)mg/L的FPP水解副产物FOH，而菌株S2则未检测到FOH。通过去除异源酶的N-端信号肽，即过表达tLPPS和tTPS，菌株S3的产量相对菌株S2提高144%，可能因为信号肽去除后更有利于蛋白表达，或它们在S.cerevisiae中的活性更高。菌株S4和S5分别表达融合的全长和融合的去除N-端信号肽的异源酶，即分别为LPPS-TPS和tLPPS-tTPS，经过香紫苏醇的产量比较，相对菌株S3，菌株S4的产量提高21%，而菌株S5反而降低84%。其中，菌株S4产量提高可能是由于蛋白质融合拉近了反应活性中心的距离，使前一步反应的产物易于到达下一步反应的活性中心，从而减少底物扩散。文献报道，将双酶催化的反应转化为一个双功能蛋白催化后，产量可增加30%以上[21]。奇怪的是，菌株S5却没有取得很好的结果，推测可能由于截短N端序列的两蛋白融合后，导致C-端蛋白 (TPS)的空间构型发生变化，降低了催化活性。为进一步提高产量，构建了菌株S6，即在前面较高产量的菌株S4中进一步过表达MVA途径的关键酶HMGR的催化部分(tHMGR)，相对菌株S4，香紫苏醇的产量提高48%。文献构建了香紫苏醇大肠杆菌工程菌株，结合高密度发酵技术，产量已达到约1.5 g/L[16]。因此，尚需要进一步改造相关途径或采用发酵工程技术，以提高S.cerevisiae工程菌株香紫苏醇产量。

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