不同样品采集方法对米糠风味物质测定的影响

曲宏宏，段文艳，唐学燕，陈 洁，曾茂茂，黄小林

（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

米糠是大米加工过程中的主要副产物，却汇集了稻谷近70%的营养物质，包括多种人体需要的营养素，是一种极具开发价值的农产品原料。然而在通常条件下，米糠极易氧化酸败，产生不良风味，影响了米糠产品在食品工业和保健品中的开发和利用。目前针对米糠风味物质的研究，国内外均鲜有报道。Phoka等利用静态顶空气质联用法（HS-GC-MS）从米糠中鉴定出了11种挥发性成分，并与传统的过氧化值（POV）检测方法进行了对比研究[1]，但并未对米糠挥发性风味物质的提取方法进行深入研究。目前，采用不同提取方法进行食品挥发性风味物质的研究较多，如静态顶空萃取法（SHS）用于分析肉类风味[2]，加速溶剂萃取法（ASE）用于鱼类风味研究[3]，同时蒸馏萃取法（SDE）用于香肠、龙虾风味的研究[4]，以及固相微萃取法（SPME）用于酒类[5]、果汁类[6]、奶类[7]、油类[8]、调味品类[9]、菌类[10]和植物[11]等的挥发性风味物质的研究。为了控制米糠风味劣变，提高米糠利用价值，首先必须要了解米糠风味的组成。因此，本文研究了米糠风味的测定方法，并重点探讨了四种风味物质的采集方法，包括静态顶空萃取法、加速溶剂萃取法、同时蒸馏萃取法和固相微萃取法对风味物质测定的影响，初步探讨了可检测到的挥发性米糠风味贡献物质，以期为米糠风味成分的分析和检测方法的确定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米糠 选用的水稻品种为水稻9031（空育131），由益海嘉里佳木斯粮油工业有限公司提供，采样后立即真空包装冷冻保藏。

SPME手动进样手柄、75μm CAR/PDMS、50/30μm DVB/CAR/PDMS和100μm PDMS萃取头 美国Supelco公司；SDE装置和Oldershow浓缩柱 江南大学国家食品科学与技术重点实验室定制；Trace GC 2000/Trace MS气相色谱质谱联用仪 美国Finnigan公司；ASE100加速溶剂萃取装置 美国戴安公司。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂制备方法 重蒸乙醚：分析纯乙醚经Oldershaw浓缩柱蒸馏，去掉前后30mL馏分、保留中间乙醚馏分备用。无水硫酸钠：550℃灼烧分析纯Na2SO4，3h，冷却，干燥器内存放备用。

1.2.2 挥发性成分提取方法

1.2.2.1 静态顶空法 取3g新鲜米糠置于22mL顶空瓶中，将顶空瓶放在40℃烘箱中平衡40min后抽取1μL顶空气体进行GC-MS分析。

1.2.2.2 加速溶剂萃取法 称取3g新鲜米糠放入萃取池中，置于转盘上。加入二氯甲烷作为萃取溶剂，在温度80℃，压力为1.5MPa的条件下萃取10min。萃取液过0.45μm的有机相滤膜后进行GC-MS分析。

1.2.2.3 同时蒸馏萃取法 原料50g，蒸馏水300g，置于500mL圆底烧瓶中接SDE装置的右端，用电热套加热保持温度在90℃左右，将内装50mL重蒸乙醚的100mL的圆底烧瓶左端与SDE连接，恒温水浴60℃加热沸腾1h。加入活化后的适量无水硫酸钠至萃取溶剂中，冷藏过夜。过滤、浓缩（Oldershaw柱，50℃水浴，分流比为10∶1），当瓶内的溶剂少于1mL时，停止加热，静置使柱内的溶剂滴下来。用洗耳球将浓缩液吹至1mL，供GC-MS分析鉴定。

1.2.2.4 固相微萃取法 称取3g米糠样品置于15mL顶空瓶中用硅树脂隔膜密封，将样品瓶置于60℃水浴中进行顶空挥发性组分平衡，选用SPME手动进样手柄，萃取头选择75μm CAR/PDMS[12]。将已老化好的指定萃取头插入顶空瓶中吸附40min。将吸附好的萃取头插入气相色谱进样口进行解吸，供GC-MS分析鉴定，解吸温度250℃，解吸时间为5min。

1.2.3 测定条件

1.2.3.1 色谱条件 PEG-20M毛细管柱（30m×0.25mm），液膜厚度为0.25μm；在40℃恒温4min后，以5℃/min的速率升温至100℃，继续以8℃/min的速率升温至230℃并保持8min。进样口温度为250℃，载气为氦气，流速为0.8mL/min，不分流。

1.2.3.2 质谱条件 电离方式为EI+，离子源温度为200℃，接口温度为250℃，m/z扫描范围为33～450amu，电子能量70eV，灯丝发射电流为200μA。

1.2.4 数据处理 实验中分析挥发性成分数据由Xcalibur软件完成，未知化合物经计算机检索同时与NIST谱库和Wiley谱库相匹配，当正反匹配度大于800，鉴定结果才予以报道。化合物以相对峰面积作为半定量结果。

2 结果与讨论

2.1 四种方法提取的风味物质分析

图1 不同提取方法条件下米糠挥发性成分的GC-MS总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of the volatile flavor components of rice bran by different extraction methods

不同的样品前处理方式对风味物质的分析有较大影响，不同的方法适合于不同的样品。通常SHS法适合于极易挥发或挥发性组分含量较高的样品[13]；ASE法主要是利用风味化合物与水溶性基质极性的差别进行分离萃取，适用于极性挥发性物质的测定；SDE法先将挥发性物质从待测样品中蒸馏出来，再将水溶性的馏分进行溶剂萃取，操作相对复杂，易造成风味物质的损失，耗时稍长且高温蒸汽作用易导致初始风味的变化，但该方法便于加入内标进行定量分析[14]；SPME法利用聚合纤维萃取头直接吸附挥发性风味物质，操作简便、快捷，但是分析结果与萃取头的吸附特性有很大关系[15]。

四种方法提取米糠挥发性成分的GC-MS总离子流图如图1所示。比较四种方法得到的同一样品的整体风味组成，SPME方法出峰物质最多，检出51种化合物，且在保留时间上分布较宽。SDE方法检出33种化合物。SHS法检出22种化合物，得到的组分保留时间相对靠后。ASE方法获得的挥发性成分过少，只检出8种化合物，该方法显然不适合测定米糠挥发性化合物，因此后续讨论将不再讨论该方法。进一步分析其他三种方法得到的米糠风味组分差异，可以看出不同前处理方法对于各类挥发性成分萃取的特异性和广谱性。对图谱进行面积归一法统计，计算图谱中各类风味物质的峰面积及占总出峰物质的相对比例，汇总结果如表1所示。

为了进一步分析四种样品前处理方法对于米糠风味成分的提取效果，我们将所提取到的成分按照醛类、酸类、酯类、醇类、酮类、苯类以及杂环类等六大类对风味有显著影响的成分进行深入分析。

2.1.1 醛类化合物 SDE法未检出醛类化合物，SHS法检出三种醛类物质，SPME法检出四种醛类物质。在SHS检测结果中醛类化合物的相对百分含量为2.6%，其中反式-2，4-癸二烯醛相对百分含量为1.7%；SPME法检测到的醛类化合物相对百分含量为7.6%，其中己醛的相对百分含量为4.7%，壬醛的相对百分含量为1.6%。

己醛和反式-2，4-癸二烯醛都是亚油酸的氧化产物，亚油酸的自氧化产生亚油酸9-和13-氢过氧化物，13-氢过氧化物断裂生成己醛[16]，脂类在低温氧化过程中会产生大量己醛，9-氢过氧化物断裂生成2，4-癸二烯醛，进一步受热转化生成更加稳定的反式-2，4-癸二烯醛[17]。己醛表现为生的油脂气味和青草气味，反式-2，4-癸二烯醛呈现的也是脂肪气味，壬醛则呈现脂肪氧化酸败的哈喇味。

2.1.2 酸类化合物 三种方法均检出酸类化合物，SHS法检出的种类最多，共有8种，其相对百分含量共为68.7%；SPME法检出5种，其相对百分含量共为2.1%；SDE法仅检出1种，其相对百分含量为14.8%。

SHS法和SDE法都检出乙酸，SPME法并未检出乙酸；SHS方法中检测出较高含量的反式油酸和亚油酸，相对百分含量分别为49.3%和18.5%，分析其来自米糠本身大量的油酸和亚油酸，反式油酸是油酸的一种单不饱和反式异构体；此外，SHS法和SPME法共同检出一些分子量相对较小的酸类化合物，如壬酸、己酸、庚酸；除此之外，SPME法还检出了异戊酸和丁酸，SHS法检出了辛酸。

丁酸、己酸呈现强烈的酸败气味[18]，异戊酸表现出难闻的汗臭气味[19]，这些小分子酸类化合物，通常由米糠脂肪中的甘油三酯和磷脂水解得到；辛酸表现为酸败臭，可能是由相应的醇、醛等化合物氧化而来。

2.1.3 酯类化合物 三种方法都检出了酯类化合物，SHS检出酯类化合物最多，共有9种，其相对百分含量为11.7%；SPME共检出8种，其相对百分含量为16.5%；SDE共检出5种，其相对百分含量为16%。

酯类化合物通常呈现出的是水果或油脂中令人愉快的芳香物质，米糠中的脂肪酸可经过氧化合成部分芳香的酯类物质，贡献米糠的部分风味。

2.1.4 醇类化合物 比较三种检测方法发现，只有SDE法和SPME法检出了醇类化合物，分别检出2种和8种，占每种方法检出物的相对百分含量分别是4.4%和9.4%。

SPME法检出的醇类化合物比例较高，醇类的产生可能来自于脂肪酸的二级氢过氧化物的分解[20]，脂质氧化酶对脂肪酸的作用[21]，脂肪的氧化分解或羰基化合物的还原[22]，脱氢酶也可以将一些脂肪酸和氨基酸生成的醛还原成相应的醇[17]。

醇类也能呈现一定的风味，例如1-辛烯-3-醇具有蘑菇、青草气味，可能源自米糠中亚油酸的氧化裂解[23]。

2.1.5 酮类化合物 酮类也是脂质氧化的产物，三种方法中只有SPME法检出了酮类化合物，共检出7种，占全部检出物相对百分含量的10%，其中丙酮的相对百分含量较高，约占4.1%，此外2-丁酮、2-癸酮的相对百分含量分别为1.8%和2%，这三种物质均呈现类似酸臭的气味，因此，可能参与构成米糠的不良风味。

2.1.6 苯类化合物及杂环类化合物 SPME法共检出6种苯类化合物，占总出峰物质的百分含量约为44%；苯类化合物主要呈现的是芳香型气味，因此推测新鲜米糠自身携带的清香可能主要来自苯类化合物的风味。其他两种方法均未检出苯类化合物。

此外，SPME法还检出一些杂环类化合物，如2-正戊基呋喃，已被初步认定为亚油酸的一种氧化产物，该物质阈值较低为4×10-9g/mL[24]，可提供类似甘草的气味[25]。

通过对三种方法获得的各类检出物的分析，并与米糠感官气味的对比，初步判断米糠特有的清香气味与类似脂肪的气味可能由苯类物质、酯类物质贡献较多，米糠呈现的类似糠臭的不良气味则主要来源于氧化产物醛、酸、醇、酮及杂环类化合物。

2.2 SHS、SDE和SPME三种方法的比较

从表1中的结果结合上述分析可知，SDE法对于提取相对较高沸点的烷烃和酯类具有特别优势，但该方法会导致低沸点化合物如醛、酮、酸和部分酯类物质的损失，另外提取过程温度较高、时间较长，可能会发生水解、氧化、酯化或分解等反应，从而导致风味物质检测结果的偏差，因此不适合米糠这种易于氧化体系中风味物质的检测。

SHS法是一种非浓缩型的方法，适合分析挥发性较强、浓度比较高的物质。本实验中只检出了酸类、醛类、酯类及烷烃类四类化合物，因此贡献米糠风味的化合物检出有限。

表1 SDE、SHS和SPME三种方法萃取风味物质的比较Table 1 Comparison in flavor components extracted by SDE，SHS and SPME

续表

SPME法萃取条件温和，挥发性物质的破坏与损失也比较小，可检出成分大大多于其他两种方法，除个别风味贡献物质如辛酸、反-2，4-癸二烯醛等未检出外，大部分贡献米糠风味的特征化合物都可在该方法中检出。尽管这种方法对高沸点的烷烃类和酯类提取能力较弱，但鉴于这些高沸点成分对米糠风味贡献有限，该方法比较适合于米糠风味物质的检测。

3 结论

综上所述，在四种常用的风味物质提取方法中，ASE法、SDE法和SHS法均不适合用于米糠挥发性风味物质的检测，而SPME法从检测的风味物质种类、数量、总峰面积、对米糠总体风味的贡献及可操作性方面均优于其他三种方法，因此，SPME法可作为米糠风味物质快速简便的采集方法，再配合GC-MS，可以对米糠风味进行较好的定性和定量分析。

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