高效液相色谱－蒸发光散射测定瓜蒌中L－瓜氨酸的含量

李爱峰，柳仁民，张永清

(1.山东中医药大学药学院，山东济南250355;2.聊城大学化学化工学院，山东聊城252000)

瓜蒌为葫芦科栝楼属植物栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim.)和双边栝楼(Trichosanthes rosthorinii Harms)的干燥成熟果实，具有清热涤痰、宽胸散结、润燥滑肠之功效，用于治疗肺热咳嗽、痰浊黄稠、胸痹心痛、结胸痞满、乳痈、肺痈、肠痈、大便秘结等症［1］。除了其重要的药用价值，瓜蒌在保健食品［2］、日用化工［3］等领域也有广泛的应用。L－瓜氨酸(L－citrulline)是首先从西瓜汁中发现的人体内非蛋白质氨基酸，广泛存在于葫芦科植物的果实中。L－瓜氨酸可以防治前列腺疾病、提高男性性功能，治疗L－精氨酸缺乏引起的相关疾病，具有促进血液循环、保护心血管、改善微循环、抗衰老、抗氧化、抗疲劳、增强免疫力、提高运动员肌肉力量与耐力及护肤去斑等重要作用［4］。目前，L－瓜氨酸的分析方法主要有氨基酸自动分析仪法、酶法［5］、比色法［6］、薄层扫描法［7］、高效液相色谱法［8］及质谱法［9］。在上述方法中，氨基酸分析仪法、酶法和质谱法价格昂贵，薄层扫描法和比色法的准确度、灵敏度都不高，而高效液相色谱法由于其分离效率高、分析速度快、准确度高等优点已成为氨基酸分析中最为有效的手段之一。由于L－瓜氨酸无紫外吸收，因此通常需要柱前衍生化处理，经常出现衍生物不稳定、步骤繁琐、操作时间长、试剂毒性强等问题。蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)是一种新的通用型、质量型检测器，特别适用于无紫外吸收的物质的检测，已广泛用于氨基酸的检测［10－12］。本文建立了HPLC－ELSD法测定L－瓜氨酸的实验方法，并用于实际样品的测定，该法简单、快速、准确、重现性好，为瓜蒌中L－瓜氨酸的定量分析提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L－瓜氨酸标准品 纯度大于99.0%，美国Sigma公司;0.45μm微孔滤膜 浙江海宁市正兴特种过滤设备制造有限公司;盐酸为分析纯 济南试剂总厂;实验用水为自制去离子水;瓜蒌药材 购于当地药店。

Unimicro HPLC泵及色谱工作站 通微(上海)分析技术有限公司;Attech ELSD2000ES蒸发光散射检测器 美国奥泰公司;WK－1000A高速药物粉碎机 青州市精诚机械有限公司;AR－1104的电子天平 奥克斯国际贸易上海有限公司;KQ3200型超声波清洗器 昆明市超声仪器有限公司。

1.2 色谱分离与检测条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB－Aq柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm);流动相:水;流速:1.0mL/min;进样量:20μL;柱温:室温;漂移管温度:115℃;空气流速:3.2L/min，分流阀状态:关。

1.3 对照品溶液的制备

准确称取L－瓜氨酸标准品100mg，用水溶解后定量转移至100mL容量瓶中，加水定容，摇匀，该溶液作为标准储备溶液。准确移取上述溶液1、2、3、4、5mL分别置于10mL容量瓶中，用水定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液。

1.4 供试品溶液的制备

精确称取瓜蒌样品适量，粉碎，以10倍量的盐酸水溶液(10－4mol/L，pH4.0)超声提取 3次，每次0.5h，过滤，合并提取液，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

由于L－瓜氨酸是水溶性氨基酸，因此首先以水为提取溶剂考察了不同的提取方法(冷浸、超声及加热回流提取)对于提取效率的影响，结果表明超声提取的效率最高，而且具有提取时间短、操作简便等优点。采用超声提取法，考察了提取溶剂的pH(2.0、4.0、6.0、8.0)对于提取效率的影响，表明当pH为4.0时提取效率最高。这是由于L－瓜氨酸的等电点为pH5.97［13］，当提取溶剂的 pH 为 6.0 时，L－瓜氨酸的静电荷几乎为零，此时水溶性最差，提取效率亦最低，当提取溶剂的pH远离等电点时，L－瓜氨酸以离子形式存在，水溶性增强，提取效率亦提高。而在碱性条件下，瓜蒌中的多糖类物质易发生糊化，增加过滤时的难度。此外，还考察了料液比、超声时间及次数对于提取效率的影响，结果表明料液比为1∶10，超声提取3次，每次0.5h即可提取完全。

2.2 色谱条件的选择

为了选择合适的色谱柱，实验考察了L－瓜氨酸在普通 C18柱、C30柱、YMC ODS－A 柱及 Agilent ZORBAX SB－Aq柱上的保留情况，结果表明其在上述前三种色谱柱上几乎没有保留，保留时间仅为2min，而在Agilent ZORBAX SB－Aq柱上有较强的保留，可能是由于L－瓜氨酸的极性太强所致。使用Agilent ZORBAX SB－Aq柱，考察了流动相的组成对于分离效果的影响，结果表明甲醇或乙腈的比例越大，L－瓜氨酸的保留时间越短，与其他强极性物质之间的分离度越差，当以水作为流动相时，L－瓜氨酸与其他组分之间的分离效果良好，保留时间也令人满意(如图1所示)。

图1 L－瓜氨酸对照品(A)及供试品溶液(B)的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of L－citrulline reference substance(A)and the sample solution(B)

2.3 ELSD参数的选择

漂移管的温度和载气的流速直接影响ELSD检测器的响应，随着漂移管的温度升高，流动相蒸发趋于完全，噪音减小，信噪比提高，但温度过高则会使流动相沸腾，噪音增大，甚至会导致组分部分汽化，响应值变小;载气的流速越小，流动相蒸发后形成的溶质颗粒越大，散射光的强度越大，响应值越大，但流速太小会使流动相蒸发不完全，噪音增大，信噪比降低。分别改变漂移管的温度和载气的流速，观察噪音和响应信号的大小，发现当漂移管的温度为115℃，载气的流速为3.2L/min，分流阀关时基线平稳，信噪比最高。

2.4 线性关系考察

分别取不同浓度的对照品溶液20μL进样分析，由色谱工作站处理数据，以质量浓度(μg/mL)的对数为横坐标，以峰面积的对数为纵坐标作图，用最小二乘法进行线性回归，得L－瓜氨酸的线性回归方程和相关系数，并以信噪比等于3为标准，测得L－瓜氨酸的检出限，列于表1中。

表1 L－瓜氨酸的回归方程、线性范围和检出限Table 1 Regression equation，linear range and detection limit of L－citrulline

2.5 精密度实验

取L－瓜氨酸对照品溶液，连续进样5次，每次20μL，分别测定峰面积和保留时间，计算保留时间及峰面积的相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)分别为0.27%和0.36%，表明该法精密度良好(见表2)。

表2 精密度实验结果Table 2 Results of precision test

2.6 稳定性实验

取L－瓜氨酸对照品溶液，每隔4h进样分析一次，连续进样6次，每次20μL，分别测定峰面积和保留时间，计算峰面积及保留时间的 RSD分别为0.84%和0.23%，表明样品在24h内稳定(见表3)。

表3 稳定性实验结果Table 3 Results of stability test

2.7 回收率实验

在已知L－瓜氨酸含量的瓜蒌样品中加入一定量的标准品，按照1.4中的制备方法制备后进样分析，平行测定5次，按照外标法定量并计算回收率，样品加标回收率均为98.36%，RSD为1.77%，表明该方法准确可靠。

表4 回收率实验结果Table 4 Results of recovery test

2.8 样品测定结果

使用该方法对市售的瓜蒌样品中L－瓜氨酸的含量进行了测定，结果见表5。

表5 样品测定结果Table 5 Determination result of samples

3 结论

本文建立了HPLC－ELSD测定L－瓜氨酸的实验方法，对实验条件进行了优化，并进行了方法学考察，结果表明该法简单、准确、快速、重现性好，适用于瓜蒌中L－瓜氨酸的含量测定，使用本方法对市售的四个不同产地瓜蒌样品中L－瓜氨酸的含量进行了测定，结果表明其含量为0.1mg/g左右。

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