复凝聚法制备山核桃油微胶囊的研究

2013-09-03王文琼包怡红

食品工业科技 2013年3期

王文琼，包怡红，王芳，王硕

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040)

山核桃(胡桃秋 Juglans mandshurica Maxim，又名核桃、核桃楸、楸子)产自黑龙江小兴安岭海拔500～800m以下，及东部山区、吉林、辽宁、内蒙古东部、河北、山西等地。山核桃油中含有多种人体必需脂肪酸，对降低人体血清蛋白中的胆固醇、防止动脉粥样硬化和血栓的形成具有积极的作用，广泛应用于食品、医药等领域［1］。而油脂易氧化变质，氧化后的油脂会产生不良风味，并引起机体的氧化，从而引发癌症和人体衰老。另外，油脂的流动性差，给调料和汤料在包装和食用时带来很大不便。经微胶囊化处理后，可将油脂制成固体粉末油脂［2］。粉末油脂是采用特殊的手段，用一些成膜性的材料将油脂微滴包埋起来而形成的一种微胶囊化的固态粉末油脂，高效包埋的粉末油脂能够避免油脂的氧化劣变、掩盖特殊异味［2］。目前，在国际上已将微胶囊技术列入21世纪重点研究开发的高新技术之一，Chang等［3］以明胶和阿拉伯胶为壁材，樟脑油为芯材，制备微胶囊，包埋率达到99.6%。通过油溶性的聚苯乙烯，改善樟脑油微胶囊的缓释效果。Weinbreck等［4］以乳清分离蛋白和阴离子多糖为壁材，通过复合凝聚法将风味油、维生素和药物等微胶囊化。20世纪80年代末，我国也开始了在这一领域的研究与实践，张韵等［5］选用壳聚糖聚阳离子及海藻酸钠聚阴离子为壁材，在溶解有香兰素的食物油表面形成多层包覆结构。真空冷冻干燥脱水获得微胶囊成品。路宏波［6］以鱼油为芯材，明胶和阿拉伯胶为壁材，以谷氨酞胺转氨酶为固化剂，采用复合凝聚法制备鱼油微胶囊，微胶囊化产率和效率分别达到94.79%和93.11%。本文以糖基化改性乳清分离蛋白和阿拉伯树胶为壁材，采用复凝聚法，制备山核桃油微胶囊，即利用乳清分离蛋白与木糖的美拉德反应产物对山核桃油进行包埋。本研究为山核桃油制品工业生产朝着方便化、营养化和功能化方向发展，提供了取用方便、性质稳定且营养价值高的优质原料［7］。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

山核桃油采自牡丹江经CO2超临界萃取制得;乳清分离蛋白美国;木糖 Sigma公司;阿拉伯树胶天津市东丽区丽昌化工有限公司;正己烷天津市富宇精细化工有限公司;冰醋酸、氢氧化钠天津市东丽区天大化学试剂厂。

KQ－500DE数控超声波清洗昆山市超声波仪器有限公司;JA2003型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司;PHS－3CpH计上海精密仪器有限公司;DHG－9240型电热恒温鼓风干燥箱上海恒科科技有限公司;EMS－8型加热定时数显磁力搅拌器天津市欧诺仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳清分离蛋白的糖基化改性将乳清蛋白和木糖按质量比2∶1比例溶解，制成60mg/mL的水溶液，采用氢氧化钠调pH9，然后放入具塞试管中。并置于烘箱中，控制在50℃条件下进行反应，反应7d，即得乳清蛋白糖基复合物［8］。

1.2.2 山核桃油微胶囊的制备利用改性乳清分离蛋白及阿拉伯树胶所带电荷相反的性质，让其在芯材表面迅速絮凝成聚电解质膜，实现对芯材的包覆。将阿拉伯树胶根据不同浓度要求，分别完全溶解在蒸馏水里。按设定比例，加入山核桃油，持续搅拌2h，使其成为乳状液，将改性乳清分离蛋白溶液倾入乳状液中，搅拌30min后，用20%冰乙酸溶液调节pH，继续搅拌1h，再用20%氢氧化钠溶液调pH，搅拌30min，最后加入转谷氨酰胺酶固定化，冷冻干燥除去水分，得到产品。其基本流程为:

1.2.3 山核桃油微胶囊包油率测定

1.2.3.1 山核桃油微胶囊表面油含量的测定参照徐满清等［9］人的方法，略有修改。称取1.00g的山核桃油微胶囊粉末，放入试管中，用20mL正己烷在轻微振动下浸提30s，立即用漏斗过滤，将滤液转移至已恒重的试管(m1)中，然后在80℃下干燥箱中烘干至恒重(m2)。表面油含量为:M=m2－m1。

1.2.3.2 山核桃油微胶囊总油含量的测定参照刘灵莉［10］的方法，略有修改。称取1.00g微胶囊化山核桃油产品物放入试管中，加入20mL正己烷后进行超声破碎，然后经4000r/min，10min离心，立即用漏斗过滤，将滤液转移至已恒重的试管(n1)中，然后在80℃下干燥箱中烘干至恒重(n2)。表面油含量为:N=n2－n1，根据式(1)计算包油率:

1.2.4 山核桃油微胶囊制备工艺参数的确定单因素实验，以包油率为指标，依次考察阿拉伯树胶添加量、山核桃油添加量、pH、改性乳清分离蛋白添加量和搅拌速度对山核桃油微胶囊包油率的影响，确定五因素四水平的最佳参数进行正交实验分析，实验设计的水平及因素见表1。

1.2.5 山核桃油微胶囊固化工艺参数的确定单因素实验，以包油率为指标，依次考察pH、转谷氨酰胺酶添加量、固化时间、固化温度对山核桃油微胶囊固化效果的影响，确定四因素三水平的最佳参数进行正交实验分析，实验设计的水平及因素见表2。

表1 制备山核桃油微胶囊正交因素水平表L16(45)Table 1 The factors and levels of L16(45)orthogonal experiment on preparation conditions of microcapsules of walnut oil

表2 山核桃油微胶囊固化正交因素水平L9(34)Table 2 The factors and levels of L9(34)orthogonal experiment on curing microcapsules of walnut oil

1.2.6 微胶囊贮藏实验研究［11］将微胶囊化的山核桃油与未微胶囊化的山核桃油置于63℃培养箱中贮存，定期取样测定样品的过氧化值，比较二者的氧化速率。称取2～3g样品，置于具塞三角瓶中，加入30mL氯仿－冰乙酸(40mL氯仿+60mL冰乙酸)混合液，溶解样品。加入1mL饱和碘化钾溶液(10g碘化钾+7g水)，立即加塞盖严，振荡摇匀，放置暗处5min。取出以上样品，加水 100mL摇匀，然后以0.01mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定，至淡黄色时，加入1mL淀粉指示剂(0.5g淀粉+50mL沸水)，继续滴定直到蓝色消失为终点。同时作空白实验(除不加样品外，其余相同)，样品过氧化值按公式(2)。

式中:V－样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(mL);V＇－试剂空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(mL);N－硫代硫酸钠标准溶液的浓度(mol/L);W－样品质量(g)。

1.2.7 数据统计分析数据统计分析采用SPSS11.5软件，每个实验重复3次，结果表示为平均值±偏差。画图采用Excel。正交实验采用正交软件V3.1进行设计及数据的处理。

2 结果与讨论

2.1 山核桃油微胶囊的制备

2.1.1 阿拉伯树胶添加量对山核桃油微胶囊包油率的影响改性乳清分离蛋白添加量为20mL，山核桃油添加量为0.8mL，pH4.5，搅拌速度为200r/min。分别考察阿拉伯树胶添加量在 2%、4%、6%、8%、10%、12%对山核桃油包油率的影响。结果由图1可知，随着阿拉伯树胶的浓度的增加，即乳化剂含量的增加，包油率逐渐升高，当阿拉伯树胶的浓度达到8%时，包油率达到最大，当阿拉伯树胶的浓度继续增加时，包油率并没有明显升高。由此可以看出，阿拉伯树胶的浓度过高并不会提高微胶囊的包油率，反而会造成壁材的大量浪费。在其他制备条件不变的情况下，阿拉伯树胶的浓度为8%时，具有较好的包埋效果，使壁材能够得到充分的利用［12］。

图1 阿拉伯树胶添加量对山核桃油微胶囊包油率的影响Fig.1 The effect of gum arabic adding on microencapsulation of walnut oil

2.1.2 山核桃油添加量对山核桃油微胶囊包油率的影响控制反应条件为:改性乳清分离蛋白添加量为20mL，阿拉伯树胶添加量为8%，pH4.5，搅拌速度为200r/min。分别考察山核桃油添加量在0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL对山核桃油包油率的影响。结果由图2可知，在其他制备条件不变的情况下，随着山核桃油添加量的增加，包油率逐渐上升，当添加量达到0.8mL时，包油率达到最大，当山核桃油添加量继续增加时，包油率呈下降趋势。即随着山核桃油添加量的增加，反应所形成的微胶囊的数量也随之增加，当山核桃油的添加量达到0.8mL时，可以达到芯材与壁材的充分利用［13］。

图2 山核桃油添加量对山核桃油微胶囊包油率的影响Fig.2 The effect of walnut oil adding on microencapsulation of walnut oil

2.1.3 pH对山核桃油微胶囊包油率的影响改性乳清分离蛋白添加量为20mL，阿拉伯树胶添加量为8%，搅拌速度为200r/min。分别考察 pH3、3.5、4.0、4.5、自然(pH4.89左右)对山核桃油包油率的影响。结果如图3所示。阿拉伯树胶和改性乳清分离蛋白作为复凝聚微胶囊的壁材，具有独特的功能特性，改性后的乳清分离蛋白表面仍具有大量的游离氨基，当在其等电点以下的溶液中时，改性乳清分离蛋白以带正电荷的粒子存在。阿拉伯树胶分子中含有羧酸，水溶液是带负电荷的聚阴离子，所以它的存在形式不受pH的影响。因此，当pH低于改性乳清分离蛋白的等电点时，改性乳清分离蛋白以正电荷的形式存在，与带负电荷的阿拉伯树胶凝聚交联。由图3可知，随pH的降低，山核桃油微胶囊的包油率呈现先上升后下降的趋势，当pH4.5时，包油率达到最大，当pH继续下降时，山核桃油的微胶囊包油率呈现明显下降的趋势。由此可以看出，山核桃油微胶囊溶液的pH对包油率的影响显著，强酸性条件下会使已经形成的微胶囊壁材溶解，从而降低山核桃油微胶囊的形成。因此，微胶囊溶液的pH在4.5左右时，有利于山核桃油微胶囊的大量形成［14－15］。

图3 pH对山核桃油微胶囊包油率的影响Fig.3 The effect of pH on microencapsulation of walnut oil

2.1.4 改性乳清分离蛋白添加量对山核桃油微胶囊包油率的影响阿拉伯树胶添加量为8%，pH4.5，搅拌速度为200r/min。分别考察改性乳清分离蛋白添加量在5、10、15、20、25mL 对山核桃油包油率的影响。结果由图4可以看出，在控制其他制备条件不变时，山核桃油微胶囊的包油率随着改性乳清分离蛋白的添加量的增加而升高，当改性乳清分离蛋白的添加量达到20mL时，包油率达到最大，随后继续增加改性乳清分离蛋白的添加量时，包油率并没有明显升高。由此可以看出，增加改性乳清分离蛋白的添加量时，会增加阿拉伯树胶与改性乳清分离蛋白复凝聚物的形成，从而提高山核桃油微胶囊成球的数量。

图4 改性乳清分离蛋白添加量对山核桃油微胶囊包油率的影响Fig.4 The effect of modification whey protein isolate adding on microencapsulation of walnut oil

2.1.5 搅拌速度对山核桃油微胶囊包油率的影响改性乳清分离蛋白添加量为20mL，阿拉伯树胶添加量为8%，pH4.5。分别考察搅拌速度在100、200、300、400、500r/min时对山核桃油包油率的影响。结果如图5所示。搅拌速度是微胶囊形成的一个重要影响因素，直接影响微胶囊的包埋率和形态。搅拌速度既影响芯材和壁材的分散程度，同时搅拌速度对瞬间形成的微胶囊稳定性也有直接关系。由图5可知，当搅拌速度为200r/min时，包油率最高，当搅拌速度为300、400r/min时，包油率都有所下降。由此可以看出，搅拌速度过慢，山核桃油和壁材之间不能充分混合，不能充分形成微胶囊，所以包油率也不高。当搅拌速度过快时，作用力过大，对形成的微胶囊造成破坏作用，而且会产生大量的气泡，影响微胶囊的形成。

图5 搅拌速度对山核桃油微胶囊包油率的影响Fig.5 The effect of stirring speed on microencapsulation of walnut oil

2.1.6 山核桃油微胶囊制备条件优化结果由于因素与因素之间存在相互作用，根据以上单因素的结果，通过正交实验来优化山核桃油微胶囊制备条件。优化结果见表2。

表2 山核桃油微胶囊制备条件正交实验优化结果Table 2 The results of orthogonal experiment on preparation conditions of microcapsules of walnut oil

根据正交实验分析的结果显示，因素的主次顺序为:搅拌速度(E)＞山核桃油添加量(B)＞改性乳清分离蛋白添加量(C)＞阿拉伯树胶添加量(A)＞pH(D)。制备山核桃油微胶囊的最佳条件为A2B1C3D2E3，即搅拌速度为300r/min，山核桃油添加量为0.6mL，改性乳清分离蛋白添加量20mL，阿拉伯树胶添加量为6%，pH4.5。但最佳制备条件不在正交实验表中，故需要做进一步的验证实验。验证实验表明，在最佳制备条件下，山核桃油微胶囊包油率为82.18%。

2.2 山核桃油微胶囊的固化

2.2.1 pH对山核桃油微胶囊固化效果的影响采用转谷氨酰胺酶作为交联剂，将凝聚反应结束后的微胶囊进行固化处理，酶浓度为15U/g阿拉伯树胶，固化温度为10℃，固化时间为6h，分别选择 pH5、5.5、6.0、6.5、7.0来对山核桃油微胶囊进行固化，结果由图6可知，固化过程中的pH对微胶囊的包油率影响较大，当pH为5.5时，包油率较低，即转谷氨酰胺酶没有较好的起到固化效果。当pH6时，山核桃油微胶囊固定化效果较好，包油率有所提高，可达83.34%。当pH为6.5和7.0时，微胶囊包油率有所下降，此时，不仅转谷氨酰胺酶没有起到较好的固定效果，而且会使部分已经凝聚的阿拉伯树胶和改性乳清分离蛋白溶解，已经被包埋的山核桃油暴露出来［16］。因此，pH6时固化效果较好。

图6 pH对山核桃油微胶囊固化效果的影响Fig.6 The effect of pH on curing microcapsules of walnut oil

2.2.2 转谷氨酰胺酶添加量对山核桃油微胶囊固化效果的影响固化温度为10℃，固化时间为6h，pH6.0，分别选择:酶浓度为 5、10、15、20、25U/g 阿拉伯树胶来对山核桃油微胶囊进行固化。结果由图7可知，转谷氨酰胺酶的用量对微胶囊的固化具有一定的影响，随着转谷氨酰胺酶用量的增加，微胶囊的包油率逐渐增加，当酶用量为20U/g阿拉伯树胶时，包油率达到最大，为83.65%，随后增加酶的用量，包油率没有明显提高。因此，适宜的酶添加量不仅可以提高微胶囊的固化效果，而且可以节约成本。

图7 转谷氨酰胺酶添加量对山核桃油微胶囊固化效果的影响Fig.7 The effect of TG－H adding on curing microcapsules of walnut oil

2.2.3 固化温度对山核桃油微胶囊固化效果的影响固化时间为6h，pH6.0，酶浓度为20U/g阿拉伯树胶，分别选择:固化温度为 5、10、15、20℃，来对山核桃油微胶囊进行固化。结果由图8可以看出，当反应温度为5℃时，微胶囊包油率较低，说明在5℃时，转谷氨酰胺酶具有较低的交联交联微胶囊壁材的活性，当反应温度为10℃时，微胶囊包油率升高，说明该温度下，微胶囊壁材交联效果良好;当温度为15、20℃时，固化效果不明显，包油率降低，因此，适宜的固化温度会提高酶的活性，从而提高微胶囊包油率。

图8 固化温度对山核桃油微胶囊固化效果的影响Fig.8 The effect of temperature on curing microcapsules of walnut oil

2.2.4 固化时间值对山核桃油微胶囊固化效果的影响固化温度为10℃，pH6.0，酶浓度为20U/g，分别选择:固化时间为 2、4、6、8、10h，来对山核桃油微胶囊进行固化。结果由图9可知，固化时间对微胶囊包油率具有一定的影响，随着固化时间的增加，微胶囊包油率增加，当固化时间为8h时，包油率达到最大，为83.90%。之后随着时间的增加，包油率没有提高。因此，固化时间太短，转谷氨酰胺酶不能完全发挥作用，固化时间太长给生产带来了浪费，选择一个合适的时间对制备微胶囊来说具有很重要的意义。

图9 固化时间值对山核桃油微胶囊固化效果的影响Fig.9 The effect of times on curing microcapsules of walnut oil

2.2.5 山核桃油微胶囊固化条件正交实验根据正交法优化固化山核桃油微胶囊条件的参数，综合单因素实验结果，确定pH(A)，转谷氨酰胺酶添加量(B)，固化温度(C)和固化时间(D)，运用正交软件V3.1设计L9(34)正交实验，对山核桃油微胶囊固化条件进行优化。正交优化结果见表4。

根据正交实验分析的结果显示，因素的主次顺序为:pH(A)＞固化时间(D)＞固化温度(C)＞转谷氨酰胺酶添加量(B)。山核桃油微胶囊固化的最佳条件为A2B3C2D3，即固化pH为6.0，固化时间为10h，固化温度为10℃，转谷氨酰胺酶添加量为25U/g阿拉伯树胶。但最佳固化条件不在正交实验表中，故需要做进一步的验证实验。最佳固化条件A2B3C2D3下固化山核桃油微胶囊后的包油率为84.15%，经固化后微胶囊表面的蛋白交联，形成稳定的刚性球结构，不易破裂。因此，包油率增加。

表4 山核桃油微胶囊固化条件正交实验优化结果Table 4 The results of orthogonal experiment on curing microcapsules of walnut oil

2.3 微胶囊贮藏期间过氧化值变化情况分析

油脂的过氧化值是衡量脂肪酸酸败程度的重要指标。结果由图10可知，油和微胶囊置于63℃环境中，在初始阶段过氧化值的变化都比较缓慢，但2d之后，未微胶囊化的山核桃油过氧化值急速增加，而山核桃油微胶囊的过氧化值增加速度仍较缓慢。分析其原因，可能是山核桃油微胶囊处于壁材膜的保护之下，油脂的氧化速度与氧气透过壁材的速度有关，致密的微胶囊壁材结构能有效地阻止氧气的渗透，另外也与改性乳清分离蛋白的抗氧化性能有关，所以山核桃油经微胶囊化处理可显著地延长其保质期。但是5d以后，微胶囊化的山核桃油粉末也开始迅速氧化，可能是因为微胶囊的壁材在较高的温度和长时间作用下原有的致密结构被打破，有部分油脂渗出，失去了微胶囊壁材的保护，油脂快速被氧化［17］。

图10 贮藏期间过氧化值变化Fig.10 The change of peroxide value during storage

3 结论

3.1 本实验所得的山核桃油微胶囊的最佳制备条件为:山核桃油添加量为0.6mL，改性乳清分离蛋白添加量20mL，阿拉伯树胶添加量为6%，pH4.5，搅拌速度为300r/min。最佳固化条件为:固化pH 6.0，固化时间为10h，固化温度为10℃，转谷氨酰胺酶添加量为25U/g阿拉伯树胶。最终包油率可达84.15%。

3.2 本实验以改性乳清蛋分离蛋白和阿拉伯树胶为壁材，转谷氨酰胺酶为固化剂，对山核桃油微胶囊制备条件进行优化实验，全过程采用低温处理技术，极大限度地保留了山核桃油的营养价值。而且复凝聚形成的微胶囊经固化后，囊壁稳定，在高温下不易解聚和破裂，复水后仍然能较好地保持微胶囊的原有状态，能最大程度的减少芯材的损失［18］。另外，木糖和乳清分离蛋白美拉德反应后的糖基化产物具有较高的还原能力和体外抗氧化能力，作为一种新型的功能性壁材，为山核桃油微胶囊产品带来较高的附加值，同时，也改变了传统单一壁材包埋的缺陷性，更为乳清分离蛋白的开发利用开辟了新途径。因此，新的功能性微胶囊壁材的开发利用，会给食品微胶囊工业带来极大的革新和进步。

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