高三尖杉酯碱对胃癌SGC-7901细胞的诱导凋亡作用

黄海进，何秀芝，焦峰

(中国人民解放军第82医院，江苏淮安 223001)

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国，胃癌发病率位于恶性肿瘤的第2位，死亡率位于第3位［1］，并且现在胃癌发病年龄逐渐年轻化，对人们的健康产生严重威胁。胃癌有效的治疗方法仍以外科手术为主，目前我国就诊的胃癌患者中大多属于中晚期，手术切除率仅为50%左右，术后5年生存率仅有20%～30%［2］，故术后化疗显得尤为重要。因胃癌发生、发展与饮食因素关系密切，所以寻找天然植物治疗胃癌具有重要的研究价值和广阔的应用前景。目前，临床上用于治疗肿瘤的植物药已筛选出20余种，包括生物碱、木脂素、柄型大环化合物、二萜类化合物等，其中紫杉醇、长春新碱等药物已经在临床上大量使用。高三尖杉酯碱(homoharringtonine，HHT)是从粗榧属植物中提取的一种生物碱，是我国自主研制成功的高效抗肿瘤药物，目前临床主要用于急性髓系白血病、慢性粒细胞白血病和骨髓增生异常综合征的治疗［3-4］。之前的研究显示，HHT治疗肿瘤的主要机制是抑制肿瘤DNA及蛋白质合成、抑制肿瘤细胞与纤维蛋白原的结合，从而抑制肿瘤细胞增殖和转移［5］。HHT抗胃癌作用的研究尚未见报道，本实验观察HHT对体外培养的人SGC-7901胃癌细胞株的抑制和诱导凋亡作用，以探求治疗胃癌的新药物。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SGC-7901细胞由上海肿瘤研究所提供，RPMI 1640培养液购自美国Gibeo公司，胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)购自杭州四季青公司，胰蛋白酶购自北京华迈科生物技术公司，乙二胺四乙酸(EDTA)购自上海永叶生物科技公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司，培养瓶、96孔培养板、培养皿均购自德国Corning公司，Annexin V·FITC/PI试剂盒购自上海晶美生物公司;CO2培养箱购自美国Forma Scientific公司，酶标测定仪购自南京莱步科技公司，FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 SGC-7901细胞在37℃、体积分数为5%的CO2条件下以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液常规培养。2～3 d换液1次，7～10 d后用2.5 g·L－1的胰蛋白酶消化传代1次。据HHT浓度分为空白对照组和HHT小、中、大剂量组(剂量依次为 20、80、120 μg·ml－1)。

1.2.2 细胞增殖抑制实验 将培养的SGC-7901细胞用胰蛋白酶加EDTA消化并稀释成(4.0～5.0)×104ml－1的活细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μl，设8个复孔，于24 h后补充新鲜培养基80 μl并加入不同浓度的药物20 μl，使HHT终浓度分别为20、80、120 μg·ml－1，空白对照组加入20 μl完全培养基，置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养至预定时间，吸弃旧培养液，加入5 mg·ml－1的MTT 15 μl，继续培养4 h后，小心吸弃全部上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡后于酶标仪波长490 nm处测定用药后24、48、72 h各孔光密度(OD)值，实验重复3次，按下列公式计算细胞生长抑制率:抑制率(%)=

1.2.3 细胞周期及凋亡率分析 以上终浓度的HHT分别作用SGC-7901细胞24 h后，0.25%胰蛋白酶消化细胞。离心弃上清，用0.1 mol·L－1、pH 7.4的PBS洗涤3次。将细胞沉淀充分混匀，用预冷的75%乙醇固定，4℃过夜。PBS洗脱乙醇后加入10 μl RNA酶和10 μl PI，4℃避光染色。30 min后用FACScalibur流式细胞仪分析细胞周期变化，ModFit LT V 3.0软件分析细胞凋亡率及细胞周期。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 细胞增殖抑制实验结果

HHT 在 20、80、120 μg·mL－1浓度下与空白对照组比较，作用24、48、72 h均能呈现一定的剂量和时间依赖关系，见表1和图1。

表1 不同浓度HHT作用人胃癌SGC-7901细胞不同时间平均OD值比较± s，n=3)

表1 不同浓度HHT作用人胃癌SGC-7901细胞不同时间平均OD值比较± s，n=3)

HHT/μg·ml－1 平均 OD值24 h 48 h 72 h 0 0.354±0.003 0.763±0.013 0.969±0.009 20 0.321±0.007 0.671±0.010 0.700±0.010 80 0.288±0.010 0.574±0.013 0.571±0.011 120 0.247±0.006 0.494±0.088 0.401±0.014

2.2 HHT对SGC-7901细胞周期的影响

不同浓度的HHT分别作用于SGC-7901细胞24 h后，G0/G1期细胞比例无明显变化(P＞0.05)，G2/M期细胞比例呈药物剂量依赖性增加，不同浓度HHT组之间差异均有统计学意义(P＜0.05，表2、图2)，S期细胞比例逐渐降低(P＜0.05)，表明存在 G2/M期阻滞。

图1 不同浓度HHT作用不同时间后SGC-7901细胞生长抑制率的变化

表2 不同浓度HHT分别作用于SGC-7901细胞24 h后不同细胞周期比例± s，n=3)

表2 不同浓度HHT分别作用于SGC-7901细胞24 h后不同细胞周期比例± s，n=3)

注:不同浓度HHT组S期与G2/M期细胞百分率之间比较，P＜0.05

HHT/μg·ml－1 细胞周期比例/%G0/G1 S G2/M 0 46.9±0.89 52.04±0.33 1.06±0.72 20 46.57±0.88 49.19±0.76 4.24±1.61 80 44.28±0.41 42.36±0.58 13.36±0.98 120 47.03±0.35 31.27±0.32 21.7±0.66

图2 不同浓度HHT作用SGC-7901细胞24 h后细胞周期及凋亡流式细胞图

3 讨 论

目前对胃癌的治疗手段中化学治疗处于极其重要的地位。但大多数药物使用后病人会有一定的不良反应，因此寻找安全有效的抗肿瘤治疗药物是一个迫切需要解决的问题［6］。

HHT来源丰富，可通过三尖杉属植物的茎、叶、根、果皮经细胞悬浮培养或组织培养和次级培养，也可以从含有HHT的植物材料或培养细胞或植物组织经溶媒提取、分离、精制得到，还可以从提取过的三尖杉属植物的残渣中经半合成方法获得［7］。

HHT能抑制真核细胞蛋白质的合成，使多聚核糖体解聚，干扰蛋白核体糖功能，对细胞内DNA的合成亦有抑制作用［8-9］。研究显示HHT对多种肿瘤细胞有抑制作用，尤其用于急性淋巴细胞或慢性粒细胞白血病有较好的疗效［10-11］。

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，如果细胞周期某一时相出现异常，细胞将进入病理过程。药物诱导细胞凋亡的作用与干扰细胞增殖周期、抑制细胞周期间的正常转化、促进细胞向凋亡通路发展有关。我们采用流式细胞仪分析HHT作用后SGC-7901胃癌细胞周期变化，结果显示HHT能够诱导细胞出现剂量依赖性的G2/M期阻滞。细胞凋亡图上呈现出随药物浓度增加而逐步增高的凋亡峰。HHT通过将SGC-7901胃癌细胞阻滞于G2/M期，干扰细胞各生长周期间的正常转化，从而以剂量依赖性方式增加亚“G1”期凋亡峰，减慢细胞周期进程、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。本研究结果进一步证实HHT对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制作用是通过促进细胞凋亡完成的。

本实验证明，HHT在体外可抑制人SGC-7901胃癌细胞增殖，其抑制率随着剂量的增加而升高，且HHT在一定剂量下能诱导人SGC-7901胃癌细胞凋亡，但其具体机制尚待进一步研究。

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［4］李玉峰，丁帮和，朱家斌，等.伊马替尼联合高三尖杉酯碱治疗初诊慢性髓细胞性白血病疗效观察［J］.东南大学学报:医学版，2009，28(5):430-432.

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