甘肃地区番茄细菌性斑点病菌的鉴定与检测

文朝慧 王军平 何苏琴

（1甘肃出入境检验检疫局，甘肃兰州 730020；2甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃兰州730070）

番茄细菌性斑点病菌——丁香假单胞杆菌番茄致病变种Pseudomonas syringaepv.tomato（Okabe）Young，Dye et Wilkie为假单胞菌科假单胞菌属丁香假单胞细菌，引起番茄细菌性斑点病，可为害番茄的叶、茎、花、叶柄和果实。因其危害的严重性，番茄细菌性斑点病菌在2007年已列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》以及《全国农业植物检疫性有害生物名单，2006》。番茄细菌性斑点病又称番茄细菌性斑疹病、叶斑病，已在30多个国家有发生的报道，可造成5%～75%的产量损失（Yunis et al.，1980）。本试验从表现番茄细菌性斑点病症状的番茄上分离病原细菌，通过致病性测定、形态特征和16S rDNA序列测定对菌株进行鉴定，并利用特异性引物对已鉴定菌株及植物发病组织进行目标细菌的PCR扩增，旨在对番茄细菌性斑点病病原菌分子检测方法进行验证，达到对病害进行快速检测的目的。

1 材料与方法

1.1 标样采集和病害症状描述

2011年7～8月在甘肃省河西地区采集细菌性斑点病症状明显的番茄果实，分装在洁净塑料袋中，保存于4 ℃冰箱5～7 d。同一个样品一部分用于分离病原细菌，另一部分用于提取发病组织总DNA进行PCR检测。

依据田间自然发病症状进行病害症状描述。

1.2 培养基、引物及试剂

金氏B培养基（KB）：蛋白胨20.0 g，甘油10.0 mL，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，琼脂 17.0 g，蒸馏水1 000 mL。

LB培养液：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL。

磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 8.0 g， Na2HPO4·2H2O 1.15 g，KH2PO40.2 g，KCl 0.2 g， 蒸馏水 1 000 mL， pH 7.2～7.4。

引物：①细菌 16S rDNA 通用引物 PF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，PR：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′；②扩增Pseudomonas syringaepv.tomato hrpZPst基因片段的特异性引物 MM5F/MM5R（Zaccardelli et al.，2005），MM5F：5′-GAACGAGCTGAAGGAAGACA-3′，MM5R：5′-CAGCCTGGTTAGTCTGGTTA-3′。PCR引物委托宝生物工程（大连）有限公司合成。

试剂：TaqDNA聚合酶、dNTP、100 bp ladder DNA marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒、Escherichia coliDH5α感受态细胞、pMD18-T载体和植物基因组提取试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；其他化学试剂为国产分析纯。

1.3 病原细菌的分离和纯化培养

采用平板划线分离法（方中达，1998）。用无菌解剖刀切取番茄果实病健交界部位组织，75%酒精消毒1 min，经无菌水冲洗3～5次后置于无菌培养皿中切碎，加无菌水浸泡20 min左右，然后用接种环蘸取该组织液在KB培养基上划线，28 ℃恒温培养。长出明显可见单菌落后，挑取少许菌脓在KB培养基上再次划线，做纯化培养。纯化菌株在KB培养基上28 ℃培养24 h，观察细菌形态及培养性状，并在紫外灯下观察是否产生荧光。

1.4 分离细菌的鉴定和特异性分子检测

16S rDNA 基因序列测定：挑取KB平板上生长24 h的新鲜单菌落至LB培养液中，28 ℃、180 r·min-1振荡培养 24 h，取 800 μL 菌液，8 000 r·min-1离心 5 min，收集菌体，用 1.5 mL 0.01 mol·L-1pH7.4 的PBS缓冲液重悬，离心洗涤3次后用800 μL 灭菌双蒸水重悬。所得菌体98℃处理5 min，于冰上放置5 min，4 ℃存放备用。扩增引物为细菌16S rDNA通用引物PF/PR。PCR 反应体系：10×PCR 缓冲液 5.0 μL，25 mmol·L-1MgCl25.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL，10 μmol·L-1PF、PR 各 1.0μL，TaqDNA 聚合酶（5 U·μL-1） 0.3 μL，模板（细菌裂解液） 2.0 μL，ddH2O 补足体积至 50 μL。PCR 扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30 个循环；72℃ 10 min。

分离细菌的特异性分子检测：用引物MM5F/MM5R扩增hrpZPst基因片段，预期扩增产物大小532 bp。以双蒸水为阴性对照。PCR反应体系：10×PCR缓冲液 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 1 μL，10 μmol·L-1MM5F、MM5R 各 1 μL，TaqDNA 聚 合 酶（5 U·μL-1） 0.3μL， 模 板（细菌裂解液） 2.0 μL，ddH2O补足体积至25 μL。PCR扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。

PCR反应结束后，取8μL扩增产物用1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果。扩增产物由柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化后与克隆载体pMD18-T连接，转化E. coliDH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选。挑取白斑，进行PCR鉴定，筛选出含有目标外源片段的重组克隆，送金唯智生物科技（北京）有限公司进行双向序列测定。测序结果与GenBank中已登录的细菌基因序列进行BLAST比对。

1.5 致病性测定

选取2个已鉴定的代表性菌株在无菌栽培的番茄苗上喷雾接种测定致病性（任欣正，1994）。接种菌液浓度为1×106cfu·mL-1，喷雾接种到6～7叶期的番茄叶片上，以接种无菌水为对照，接种后的植物材料置保湿桶中保湿48 h，保持28 ℃。每天观察发病情况，待植株发病后从病斑上再次分离病原细菌。

1.6 引物的特异性验证

检测所用的番茄细菌性斑点病菌、番茄溃疡病菌、成团泛菌、假单胞杆菌、金黄杆菌、短小杆菌和不动杆菌均分离自甘肃河西地区的番茄病果；分别制备所有供试细菌的裂解液为模板进行特异性引物的PCR扩增，以验证MM5F/MM5R引物的特异性。PCR扩增体系及扩增程序与1.4相同。

1.7 田间样品的分子生物学鉴定

利用植物基因组提取试剂盒提取番茄发病组织总DNA，紫外分光光度计检测所提取DNA的纯度，并将DNA浓度调至约20 ng·μL-1。以此DNA为模板，用引物MM5F/MM5R进行PCR扩增，检测病样中的细菌。

2 结果与分析

2.1 病害症状

番茄细菌性斑点病的染病叶柄和茎产生黑色斑点，易连成斑块，周围无黄色晕圈（图1-a）；染病叶片产生近圆形或不规则斑点，深褐色至黑色，周缘具黄色晕圈（图1-b、c）；幼嫩绿果染病，初现稍隆起的黑褐色小斑点（图1-d），随着病害的发展，果实近成熟时，围绕斑点的组织仍保持较长时间绿色，病斑不溃腐，病斑周围黑色，中间色浅，呈黄棕色，并有轻微隆起，但病斑整体凹陷（图1-e～i）；田间湿度大时，病斑周围可见浸润环，病斑上可产生灰白色菌脓（图1-f）。

2.2 病菌形态特征及培养性状

分离纯化的9个细菌菌株革兰氏染色阴性，菌体杆状，无荚膜，无芽孢，大小为（0.5～1.0）μm×（1.5～5.0）μm。菌株在KB培养基上28 ℃培养2 d，形成圆形淡黄绿色菌落，菌落全缘，表面光滑，不透明，黏稠状，菌落直径2～3 mm。在 紫外灯下观察产生黄绿色荧光。

2.3 基于16S rDNA 的鉴定和特异性分子生物学鉴定

以供试菌株裂解液为模板进行16S rDNA 的PCR扩增，得到约1.5 kb的PCR产物，扩增产物转化连接后进行双向测序，测序结果表明，该片段长1 502 bp。将测定的序列（登录号：JQ945223）在NCBI进行BLAST比对，该序列与GenBank中已有P. syringaepv.tomato的16S rDNA序列同源性达99%。结合菌落、菌体形态特征、革兰氏染色及致病性测定结果，将该菌株鉴定为丁香假单胞杆菌番茄致病变种（P. syringaepv.tomato）。

检测引物MM5F/MM5R在分离纯化的9个菌株（表1）中均扩增出预期大小的特异性片段（图2），随机选取扩增产物转化连接后进行双向测序，所得序列与GenBank中P. syringaepv.tomato的特异性序列同源性达100%，表明9个菌株均为P. syringaepv.tomato。

2.4 致病性

供试菌株喷雾接种后第5天开始出现症状，叶片上产生深褐色不规则斑点。发病后取叶部病组织再分离，获得菌落及革兰氏染色特征与原纯培养一致的细菌。

图1 番茄细菌性斑点病自然发病症状

2.5 引物特异性验证

引物MM5F/MM5R能从供试的Pseudomonas syringaepv.tomato7个菌株中特异地扩增出一条530 bp左右的条带，而其他供试菌株及空白对照无扩增条带或扩增出非特异性条带（表1，图3）。表明该引物具有特异性，可以将P.syringaepv.tomato与番茄可能携带的其他细菌区分开。

图2 引物MM5F/MM5R的PCR扩增结果

2.6 田间样品的分子生物学鉴定

分别从番茄发病组织提取总DNA，用引物MM5F/MM5R 进行PCR检测，电泳结果显示，所有7个病样均产生清晰的特异性扩增条带（图4），因此该引物对为Pseudomonas syringaepv.tomato快速检测的特异性引物。

表1 试验所用细菌菌株

图3 引物MM5F/MM5R的特异性检测

图4 自然感病番茄PCR检测

3 结论与讨论

番茄细菌性斑点病已在我国的部分省份和地区发现（冯凌云 等，2000；赵廷昌 等，2001；赵子俊 等，2001；王晓辉 等，2006；杨春泉 等，2008；李志栋，2010），为局限性发生。病菌在田间通过雨水、昆虫、农事操作进行传播（赵廷昌 等，1999），播种带菌种子，幼苗即可发病，田间只要有10%的植株发病，就可传播至整个地块，造成流行。

在甘肃省，邓刚等（2008）报道2006～2007年间张掖地区番茄大面积发生番茄细菌性斑点病类似病害，发病率达40%～100%。笔者在调查中发现，2000年12月，兰州市红古区一农场的3.33 hm2日光温室番茄中，约有2.67 hm2不同程度发生番茄细菌性斑点病类似病害；2004年11月，榆中县和平镇一农场的1 334 m2日光温室中，正值开花期的番茄严重感染细菌性斑点病类似病害；2011年 8月，张掖市的辣椒上也有该病害的发生。鉴于目前该病害有蔓延和加重的趋势，为防止番茄细菌性斑点病向非疫区的传播蔓延，应提高对病害的识别能力，严格执行检疫措施，加强种子检疫。

特异性是检测特定病原菌所必需的条件。hrpZ基因是植物病原细菌所独有的基因，其编码产物与致病性有关（James & Alan，1997），研究表明该基因是丁香假单胞菌致病变种快速鉴定的理想分子指标（Zaccardelli et al.，2005），引物MM5F/MM5R扩增的目的片段是P. syringaepv.tomato的hrpZ基因。利用引物MM5F/MM5R对分离自番茄病果的16种细菌菌株进行特异性扩增，可从P. syringaepv.tomato中扩增得到一条530 bp左右的条带，而其他供试菌株无扩增条带或仅有非特异性条带出现，验证了该引物具有特异性，可以将P. syringaepv.tomato与番茄可能携带的其他细菌区分开，可作为分子检测的特异性引物。

与常规细菌学鉴定试验相比，hrpZ基因的分子鉴定具有快速、易操作、结果客观等优势。利用扩增hrpZPst基因片段的引物MM5F/MM5R，可以直接从植物组织总DNA中扩增出番茄细菌性斑点病病菌的特异性条带，能快速检测病原细菌，便于及时对病害进行防控。

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