引起仔猪关节肿大的传染性病原检测分析

储玉双,黄小红,胡善辉,蔡艳,万培伟

（江西生物科技职业学院，江西 南昌 330200）

在规模化猪场，多发性关节炎引起的仔猪关节肿大越来越多。引起关节肿胀的主要病原菌有猪链球菌、猪丹毒杆菌、衣原体病、猪葡萄球菌、棒状杆菌属、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、放线菌、猪鼻支原体等[1，2]。2008年吴峙宏、石超军[3]对某猪场流行的一种以腿部关节肿大为特征的慢性疾病，进行了细菌的分离纯化、形态和培养特性观察以及生化测定应用PCR 对9株可疑病株进行了检测，均能扩增出预期大小的特异性片段，综合细菌的培养特性和染色镜检以及生化实验可以确定此猪场仔猪关节炎的病原为链球菌。1997年，孙裕光、沙莎[4]从诊治的15头患病猪中选择了关节炎病情严重的3头猪做了病理学及细菌学检验,证明该病的病原为多杀性巴氏杆菌。1999年张耀相、梁荣等[5]从某猪场发生一种以脓性、干酪性关节炎为特征的病例中，分离到数株G+棒状细菌，鉴定为化脓放线菌，曾称为化脓棒状杆菌。这些细菌侵害猪的蹄部、腕部、肘部关节等，在局部引起红、肿、热、痛，导致关节炎，从而引发四肢运动机能障碍。其中细菌引起的仔猪关节肿大已成为许多猪场的严重问题之一，给猪场的生产造成较大的损失，表现为生长速度减慢，饲料转化率降低，某些情况下甚至可能引起死亡。

近年来，由于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）的广泛流行[6]，造成猪群出现免疫抑制，仔猪关节肿大的感染和发病率升高。仔猪关节炎的发病有呈单一感染，大部分与其他细菌呈混合感染，也有引起继发感染的报道。叶清超[7]报道了福建平和县小溪镇某养猪场在2006年10月发生了一起以急性、热性、出血性并伴有关节肿胀、脑膜炎和败血症为特征的急性传染病，应用多种抗生素治疗无效。根据流行病学、临床症状观察、病理剖检变化、实验室检查结果，确诊为猪瘟继发猪链球菌病。

仔猪关节肿大因妨碍养猪业的发展和造成巨大的经济损失而逐渐引起养猪业者的重视，但因对其发生原因等缺乏认识，从而在防治措施上无所适从。此文通过对关节液中病原的分离、培养、生化鉴定以及药物敏感试验来分析病原，并归纳出对细菌性病原敏感的药物种类，对治疗该类疾病提供依据。

1 实验材料

1.1 病料来源

江西新建县、樟树市、进贤县、高安市、南昌县等多个地区现场采集的关节液及送检仔猪关节肿胀的50份病料，一经送到，立即进行病原的分离培养。

1.2 主要培养基

营养琼脂培养基、巧克力琼脂培养基、血液琼脂培养基、TSA 固体培养基（胰蛋白大豆琼脂）、TSB 液体培养基(胰蛋白大豆肉汤)、麦康凯培养基。

1.3 主要试剂

V 因子（NAD 烟酰胺腺嘌吟二核苷酸），上海生物工程技术服务有限公司；无菌胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；药敏纸片，生化微量鉴定管，杭州天和微生物试剂有限公司；TSA、TSB，Difco公司；革兰氏染色液、芽孢染色液及其他分析纯，本试验室提供。

1.4 主要仪器设备

培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、高压灭菌器、超净工作台、电子显微镜、冰箱、自动双蒸水蒸馏器、电子天平、接种棒、烛缸、无菌培养皿、镊子、酒精灯、托盘、电子万用炉、直尺等。

2 实验方法

2.1 关节液的采取

2.1.1 送检关节液的采取。在超净工作台的紫外灯打开照射20～30min 后，关掉紫外灯。将病料放入托盘中，用镊子夹住一个酒精棉球，擦拭猪关节周边的污染物，丢弃。再取一个酒精棉球，在酒精灯点燃，对准猪腕关节或跗关节上下转动灼烧至猪毛褪去。10mL 的一次性注射器插入关节的凹处，抽取关节液。得到的关节液保存在4℃的冰箱内，待用。

2.1.2 活体猪关节液的采取。到猪场采取活体猪关节液时，由饲养员帮忙固定，在注射点周边用高锰酸钾液冲洗，再用酒精棉球擦拭，应用一次性注射器抽取关节液。得到的关节液放入装有冰袋的塑料箱内，在7h内带入试验室进行病原分离培养。

2.2 病原菌分离

在无菌操作条件下在采取的关节液一滴于TSA培养基、营养琼脂培养基或巧克力琼脂培养基中，划线接种，37℃培养24～48h，观察菌落形态，然后挑取可疑单菌落，转接相同的培养基进行纯培养。

2.3 涂片染色镜检

2.4 生化鉴定

在无菌操作台上，用接种环分别挑取纯培养的单菌落于（葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、山梨醇、甘露糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、尿素、棉子糖、血清菊糖)等微型生化鉴定管，将分离的 A、B、C、D、E、F菌同时加入0.01%的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）5μL，置于37℃0.5%的CO2 培养箱培养48 小时，观察结果。再将 A、B、C、D、E、F 菌不加入 0.01% 的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）37℃培养24 h 后，观察其对糖的利用情况。

2.5 药敏试验

药敏试验根据美国临床标准委员会 (NCCLS)推荐的K－B 琼脂法进行。试验所选择药物一般包括下列抗生素：氨苄西林(AMP)，头孢曲松(CRO)，庆大霉素(GM)，万古霉素(VA)，环丙沙星(CIP)，诺氟沙星(NOR)，四环素(TBT)，乙酰螺旋霉素(ASP)，等。药敏结果判定标准按照NCCLS 手册2005 版[8]。

3 结果与分析

3.1 关节变化

关节肿大变形，注射器抽取的关节液可见有淡黄色粘液，个别严重者有脓性较粘稠分泌液。

3.2 细菌分离结果

A、分离到在普通琼脂平板或TSA 平板上37℃孵育24～48h 后可形成金黄色的1～2mm 的圆形、凸起、光滑、湿润、不透明的菌落32份。

B、分离到在TSA 培养基上37℃孵育24～48h 后形成菌落细小，直径0.5～1mm 的透明、发亮、光滑、圆形、边缘整齐的菌落，在血琼脂平板中37℃培养24h后，形成灰白色、圆形、透明、闪光、中央隆起、表面光滑的露珠状小菌落9株，其中溶血的2株，不溶于血的有7份。

C、在TSA（加入了牛血清和NAD）培养基中37℃孵育48～72h 后观察到针尖大小、无色透明、光滑湿润的露珠样菌落1份。

D、在血琼脂平板37℃培养24h～48h 后，形成细小露滴样菌落，并形成明显的β型溶血的菌落8份。

E、在血清琼脂平板上37℃培养24h，可长成淡灰白色、边缘整齐、表面光滑、闪光的露珠状小菌落。在血琼脂平板上，长成水滴样小菌落，形成明显的β型溶血3份。

F、在TSA（加入了牛血清和NAD）培养基中37℃培养 24h～48h，形成圆形、凸起、光滑、湿润、不透明偏黄色长成一片的8份。

细菌分离结果显示A 菌分离到的菌落很多，而B、D、F 菌相对较少，E 菌和C 菌很难分离得到，一方面可能由于细菌的培养条件的限制，另一方面细菌定居致病不同，当然与猪场先前的预防免疫防治存在很大的关系。在50份病料关节液中，分离培养时未生长细菌的有20份。

3.3 涂片镜检结果（见表1）

通过病原的分离培养及涂片镜检的结果，初步怀疑A 是葡萄球菌，B 是链球菌，C 副猪嗜血杆菌，D 是化脓棒状杆菌，E 是多杀性巴氏杆菌，F 是芽孢杆菌。

表1 仔猪关节肿大分离菌的涂片镜检结果

3.4 生化鉴定结果(见表2)

表2 疑似菌株生化鉴定结果

3.5 药敏试验结果

各疑似菌株及仔猪关节液的药敏试验培养菌抑菌圈直径见表3。

与CLSI 操作手册进行比对，得出细菌A、B、C、D、E 及关节液对15种抗菌药物的敏感程度结果如下：

A 菌株对卡那霉素、头孢唑啉、头孢曲松高敏，对青霉素、庆大霉素、乙酰螺旋霉素中敏，对四环素、氯霉素、链霉素、诺氟沙星不敏感。

B 菌株对氨苄西林、头孢唑啉、头孢曲松、乙酰螺旋霉素高度敏感，对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星、诺氟沙星、青霉素中度敏感，对链霉素、四环素、氯霉素不敏感。

C 菌株对头孢曲松、头孢唑啉、诺氟沙星、万古霉素、环丙沙星高敏；对卡那霉素、氯霉素、四环素中敏；对链霉素、氨苄西林低敏；对青霉素、庆大霉素不敏感（NS）。

D 菌株对卡那霉素、新生霉素、诺氟沙星、呋喃妥因、头孢唑啉高度敏感；对四环素、氯霉素中度敏感；对青霉素、庆大霉素、链霉素不敏感。

E 菌对庆大霉素、青霉素、链霉素、环丙沙星、氨苄西林、头孢唑啉、头孢曲松高等高度敏感；对卡那霉素、氯霉素的敏感性很低，对万古霉素、乙酰螺旋霉素、呋喃妥因不敏感。

关节液分离菌对庆大霉素、万古霉素、氯霉素、卡那霉素、呋喃妥因、乙酰螺旋霉素敏感；对头孢唑啉、新生霉素、环丙沙星、诺氟沙星中敏；对氨苄西林、青霉素、四环素低敏；对链霉素不敏感。

表3 疑似菌株生化鉴定结果 mm

4 讨论

4.1 关节液的采集

病料采集前，要了解病猪是否用药，用了哪些药，近期是否进行过免疫接种，为以后分离菌的药敏试验及防治提供参考依据。但因为大部分是送检的病料，未了解到相关的情况。无论是去猪场采集还是送检的病料，病变关节液的采集过程中都要特别注意到无菌污染的要求，因为空气中的病原菌以及猪关节表面的污染菌都会影响试验的细菌分离结果。

病料在采集、保存和运输时，采取病料应在动物死后立即进行，夏季不能超过6h，否则尸体腐败或肠道内的细菌侵入内脏而造成污染，影响检验结果。病变关节液用灭菌注射器抽取脓肿之脓汁，置于灭菌EP 管中。对较粘稠的脓汁，可向脓肿内注入1～2mL灭菌生理盐水，然后再吸取。副猪嗜血杆菌通常在死亡病例难以分离到，常采取发病典型病例人工致死的方法，取新鲜病料，又由于其非常娇嫩，从选取病料到送检一般不超过12h，否则难以分离得到。刚采集到的病变关节液要放入4℃冰箱保存备用。

4.2 病原的分离

导致仔猪关节肿大的不止一种病原菌，常常一份关节液中会分离到几种不同的菌株。所以对这些菌株哪些是致病菌，哪些是病变关节液中的常在定居菌；关节肿大是由其他疾病继发或几种疾病混发等问题很难判断。

也有未见菌落生长的情况（夏冬季居多，春秋季较少）。从初步鉴定到进一步选择培养基进行的纯培养、分离鉴定都要及时、准确，当天的事当天完成。葡萄球菌在普通琼脂培养基上即可生长，很容易分离到；链球菌、化脓棒状杆菌等在血琼脂培养基上培养，观察溶血性，分离情况受临床用药及疾病的严重程度而定，症状较轻微，病原微生物的定居及量的多少，都对病原分离有重大影响。HPS 在病料中十分娇嫩，因此用于细菌分离的病料的选取要选择典型病例的病变器官，而关节液分离到副猪嗜血杆菌的报道很少，常见是在猪鼻腔、浆膜表面物质或渗出液、心包等组织器官采样分离到。本试验唯一分离到的一株也是在发生该疾病同窝的急性发病期，关节肿胀、跛行非常严重，且有发病死亡病例的情况下，采集活体猪关节液分离得到。

4.3 生化鉴定

为了达到特异性的鉴别病原菌，不同菌的生化鉴定采用不同的鉴定条件，这就要求在初步分离培养、涂片镜检的基础上锁定病原菌的范围，进一步按照细菌系统鉴定手册的生化鉴定项进行检验。其中，副猪嗜血杆菌生化鉴定需同时加入5μL 0.01%的NAD，满足菌株生长的需要。细菌生化鉴定结果大部分与鉴定手册相同，几项结果不一致可能是因为操作不当，未接种到相应的菌落，出现阴性的结果或生化鉴定管的颜色无变化等。

4.4 药物敏感试验

通过对各个病菌及关节液的耐药性分析，发现之间存在很大差异，各个病菌存在差异是确定，但总的关节液的抑菌圈直径存在很大差异，每次的结果不一样，这与抗菌药物使用频率的增加，耐药谱越来越宽，各个地方的发病和用药情况的不一样，药敏试验也有所差异[9]。在总的关节液的药敏试验中，有对全部病菌都有抑制作用的药物，如头孢唑啉；有对其中一种或几种病菌有耐药性，抑菌圈的直径有大有小，如环丙沙星、四环素等；也有完全没有抑菌作用的药物，如链霉素，抑菌圈直径为0mm。对于临床混合发病及继发的病例的治疗提供了参考。

[1]李义明，韩敏，刘涛等.猪跛行的原因及防治[J].养殖技术顾问，2008(9):26～27.

[2]Nielsen N c et al:No rd(1975)V et.M ed.27、529～543.

[3]吴峙宏，石超军.一起仔猪关节炎型链球菌的分离与鉴定[J]，河南畜牧兽医，2008（05）：9～11.

[4]孙裕光，沙莎.哺乳仔猪关节炎病原分离鉴定及治疗药物选择[J]，中国畜禽传染病，1997（05）.

[5]张耀相，梁荣，梁督军.猪化脓性干酪性关节炎的细菌学诊断[J]，畜牧兽医杂志，2000（01）.

[6]陈桂香，银梅，朱彦彩等.猪高热综合症病因的调查与分析[J].河南科技学院学报，2009(2):30～31.

[7]叶清超.某猪场猪瘟继发猪链球菌病的诊断及防治[J].福建畜牧兽医，2008.

[8]R.E.布坎南,N.E.吉本斯等编.伯杰细菌鉴定手册(第八版)[M].北京:科学出版社，1984.

[9]王科喜，王占锁，王建平.猪关节性疾病的防治措施[J].畜禽业，2010(11):72～73.