重组禽流感病毒灭活疫苗（H9N2亚型，Re-9株）对2010年～2011年流行病毒株免疫效力的研究

杨 婧，曾显营，张盼涛，冯华朋，李倩倩，邓国华，李雁冰，田国彬，陈化兰

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室/国家禽流感参考实验室，黑龙江哈尔滨 150001）

H9亚型禽流感病毒（Avian influeuza virus，AIV）为低致病性病毒，呈世界性分布，一般可分为北美和欧亚两个种系[1]。我国H9亚型AIV属于欧亚种系，于1970年首次在香港发现，1990年左右开始在中国大肆流行[2]。H9亚型AIV除可以造成禽呼吸道疾病外，同时可能造成蛋鸡产蛋量下降及肉鸡生长缓慢；并常与其它病毒病或细菌病混合感染，可造成较高的死亡率[3]。近年来，有研究表明一些H9亚型AIV对人源唾液酸受体的亲和力逐渐增强，并有报道人类感染的临床病例，对公共卫生安全构成威胁[4-6]。因此，对H9亚型禽流感（AI）的研究和防控具有重要的经济和公共卫生意义。

疫苗免疫是我国控制H9亚型AI的重要措施之一，我国有不同单位研制或生产的多株H9N2亚型AIV灭活疫苗，并在我国广泛应用。而在活禽市场中依然能够监测到大量的H9N2亚型AIV。为获得更好的免疫保护效果，本实验室在分析大量H9N2亚型AIV后，利用成熟的反向遗传操作技术，研制出Re-9株病毒，已有试验结果表明该疫苗能对2008年的流行病毒株的攻击提供良好的免疫保护作用[7]。由于AIV易发生基因重组，因此选择我国近两年流行的5株分离株重新评估Re-9株的免疫保护作用。

1 材料和方法

1.1 病毒株 H9N2亚型重组AIV Re-9株由本实验室构建，其亲本株为A/Chicken/Hunan/S933/2008（简称HuN33）；5株攻毒株分别为：A/Chicken/Chongqing/S1258/2011（简 称 CQ58）、 A/Chicken/Liaoning/S3037/2010（简称 LN37）、A/Chicken/Guangxi/S1435/2010（简称 GX35）、A/Chicken/Fujian/S1239/2010（简称 FJ39）、A/Duck/Hubei/S1146/2011（简称HuB46），均由本实验室分离、鉴定和保存。

1.2 SPF鸡胚和SPF鸡 9日龄～11日龄SPF鸡胚和4周龄的SPF鸡均由本所实验动物中心提供；动物饲养和感染实验均在负压隔离器中进行。

1.3 疫苗的制备 按照现有H9N2亚型AIV灭活疫苗规程，以Re-9株为毒种制备灭活疫苗。

1.4 HA基因和NA基因的同源性分析 对疫苗株Re-9与亲本株HuN33和2010年～2011年分离的5个代表株CQ58、LN37、GX35、FJ39、HuB46进行HA基因和NA基因的测序，用Megalign进行同源率分析。

1.5 病毒株的鸡胚半数感染量（EID50）测定 将CQ58、LN37、GX35、FJ39、HuB46 5 个分离株分别用无菌PBS作10倍倍比稀释，取10-5～10-106个稀释度，每个稀释度以尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚5枚，37℃孵育72 h后，测定鸡胚尿囊液的HA价，利用Reed-Muench法计算病毒的EID50。

1.6 病毒株的抗原性分析 分别将Re-9株和CQ58、LN37、GX35、FJ39、HuB46制备成灭活苗，分别免疫3只4周龄的SPF鸡，制备抗血清，进行抗原性分析。按照文献[8]方法计算各病毒株之间的抗原相关值（R），R=r1·r2×100%。R为抗原相关值，r1为血清1对病毒2的HI滴度与血清1对病毒1的HI滴度之比；r2为血清2对病毒1的HI滴度与血清2对病毒2的HI滴度之比。

1.7 灭活疫苗免疫效力试验 将Re-9株灭活疫苗以0.3 ML/只的剂量免疫60只4周龄的SPF鸡，取30只同日龄SPF鸡作为对照。每周采血检测HI抗体水平，免疫3周后，对免疫组鸡与同条件饲养的对照鸡，分别将亲本HuN33病毒株和2010年～2011年所筛选的5个分离株H9N2亚型AIV以静脉途经接种，0.1m L/只（含2×107EID50）。攻毒后第3 d、5 d、7 d采集喉头和泄殖腔拭子进行病毒分离，检测排毒情况，病毒分离阴性样品则盲传1代。对免疫攻毒鸡进行排毒检测，喉头或泄殖腔拭子病毒分离阳性均计为该只鸡排毒。

2 结果

2.1 HA和NA基因的同源率比较 Re-9和HuN/33的HA和NA的核苷酸及氨基酸的同源性均为100%。5个分离株HA核苷酸之间的同源率为90.2%～96.4%，HA氨基酸之间的同源率为93.4%～97.4%；NA核苷酸之间的同源率为87.1%～96.5%，NA氨基酸之间的同源率为88.5%～96.0%。5个分离株与Re-9的HA核苷酸之间的同源率为90.6%～97.5%，HA氨基酸之间的同源率为92.9%～98.0%；NA核苷酸同源率为88.1%～98.7%，NA氨基酸之间的同源率为89.1%～98.3%。

其中FJ39的NA基因推导氨基酸序列的同源性与其余6株病毒株相差较大，HuB46的HA和NA基因及其氨基酸与其余6株病毒株同源性最相近。

2.2 病毒株EID50测定 病毒株通过SPF鸡胚滴定结果显示，每 0.1 ML的 HuN33、CQ58、LN37、GX35、FJ39和HuB46的病毒含量依次分别为108.6EID50、108.5EID50、109.3EID50、108.6EID50、108.8EID50和109.2EID50。

2.3 病毒株抗原性分析 对经分别免疫2010年～2011年分离的5个代表株和Re-9株灭活疫苗而制备的抗血清进行交互血凝抑制试验（表1）。

表1 AIV抗原性分析Table 1 Antigenicity analysis of AIV isolates

Re-9的抗原对5个分离株血清的交互HI值较高，并且各分离株对疫苗株血清的交互HI值的差异在2 log2以内。用我国分离的H9N2亚型AIV早期 分 离 株 CK/GD/6/97（GD6）， DK/NJ/2/97（NJ2），CK/BJ/8/98（BJ8）和 CK/HB/31/00（HB31）血清对该 5个分离株抗原的HI抗体效价相差8 log2左右，存在较大差异；5个分离株之间的差异在4 log2左右。按照文献[8]介绍的方法计算各病毒株之间的抗原相关值 R，R=r1·r2×100%（表 2）。

表2 5个分离株与疫苗株之间抗原相关值（R）测定结果Table 2 Antigen correlation value（R）of the H9N2 subtype AIVs

结果显示5个分离株之间的抗原相关值为66.67%～100%，而Re-9株与该5个分离株之间的抗原相关值为88.89%～100%（表2）。

2.4 灭活疫苗免疫效力试验 对相同条件下的免疫组和对照组鸡只以2×107EID50静脉途经攻毒后，采集攻毒后3 d、5 d、7 d的喉头和泄殖腔拭子，接种鸡胚以检测排毒情况，具体数据见表3。即对照组3 d时排毒的比例分别为：100%（5/5）、100%（5/5）、100%（5/5）、100%（5/5）、100%（5/5）、100%（5/5），5 d时排毒的比例分别为：100%（5/5）、100%（5/5）、100%（5/5）、80%（4/5）、80%（4/5）、80%（4/5），而且攻毒后7 d依然有不同程度排毒。而免疫组在攻毒后3 d、5 d和7 d，拭子样品病毒分离均为阴性，而且所有鸡只在攻毒后14 d观察期内均无任何不良反应，表明Re-9株灭活疫苗能够对2010年～2011年监测到的病毒株攻击提供良好的免疫作用。

表3 攻毒后拭子的病毒检测结果Table 3 The virus shedding detection from trachea and cloaca swab samples post challenge

3 讨论

由于H9N2亚型AIV为低致病力病毒，因此较少引起关注，而近几年该病毒的分离率与以前相比明显上升[9]。从HA遗传进化树上分析可知近几年流行的H9N2亚型AIV仍为类A/CK/Beijing/1/94病毒株，但分析其序列表明当前流行的病毒株与2009年以前病毒株相比已经发生了变异，而且病毒不是限制在某些区域内，而是在大范围内或全国流行。这与王寿山等[10]报道的相一致。由于H9N2亚型AIV具有上述特点，有研究者认为有必要进行新的AI疫苗株的筛选[11]。许传田等所筛选的疫苗株CK/SD/SG2/2009在攻毒后第3d有效保护率70%以上，第5 d保护率达到90%[12]。万晓鹏等对2008年～2010年在我国不同地区监测到的55个分离株AIV系统筛选，实验结果表明CK/HuN/33/08是理想的疫苗候选株[7]。

疫苗株的基因同源性和抗原性差异是影响疫苗免疫效果的关键因素[13]。Re-9株与流行代表病毒株之间HA氨基酸的同源率为90.6%～97.5%，NA氨基酸同源率为88.1%～98.7%，并且其抗原相关值在88.89%～100%，Re-9的基因同源性和抗原性相关值均较高，在理论上具有典型疫苗株的特点。

HuN33具有良好的免疫原性，能够对不同地区和来源的流行病毒株的攻击提供理想免疫保护，本实验利用反向遗传操作技术以HuN33的表面基因HA和NA基因及H1N1/PR8病毒的6个内部基因为供体重组构建疫苗毒Re-9株，并进行了系统评估。重组病毒对家禽和哺乳动物均呈低致病性，显著降低了在疫苗研制和大生产过程中感染和传播的风险[14]。以Re-9株制备的灭活疫苗在攻击亲本株和2010年～2011年5个分离株后的保护率均为100%，表明Re-9株灭活疫苗不仅可以抵御同源病毒的攻击，而且对5个异源病毒株的攻击也具有较好的保护作用。因此，Re-9株是可用于当前H9亚型AI预防的理想疫苗株。

[1]Alice F,Isabella M,Annalisa S,et al.Phylogeography and evolutionary history of reassortant H9N2 viruses with potential human health implications[J].Virology,2011,85:8413-8421.

[2]Li Cheng-jun,Yu Kang-zhen,Tian Guo-bin,et al.Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China[J].Virology,2005,340:70-83.

[3]Kishidal N,Sakoda Y,Eto M,et al.Co-infection ofStaphylococcus aureusorHaemophilus paragallinarumexacerbates H9N2 influenza virus infection in chickens[J].Arch Virol,2004,149:2095-2104.

[4]Matrosovich MN,Krauss S,Webster R G.H9N2 influenza viruses from poultry in Asia have human virus-like receptor specificity[J].Virology,2001,281:156-162.

[5]Butt K M,Smith G J,Chen Hua-lan,et al.Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in Hong Kong in 2003[J].JClin Microbiol,2005,43:5760-5767.

[6]Ji Kang,Jiang Wen-m ing,Liu Shuo,et al.Characterization of the hemagglutinin gene of subtype H9 avian influenza viruses isolated in 2007-2009 in China[J].J Virol Meth,2010,163:186-189.

[7]万晓朋，曾显营，田国彬，等.H9N2亚型禽流感流行株灭活疫苗种毒的筛选[J].中国预防兽医学报，2010，32（4）：276-280.

[8]杨汉春.动物免疫学[M].北京：中国农业大学出版社，1995：146-147.

[9]赵坤坤，仲书官，赵国，等.2009-2010年华东地区家禽低致病性AIV的流行病学调查与分析[J].中国兽医学报，2012，32（3）：345-349.

[10]王寿山，张超林，刘春国，等.H9N2亚型AIVHA和NA基因的序列分析[J].黑龙江畜牧兽医，2012，7：113-115.

[11]Suarez D L,Schultz S.Immunology of avian influenza viruses:a review[J].Dev Comp Immunol,2000,24:269-283.

[12]许传田，鲁梅，胡北侠，等.H9N2亚型禽流感疫苗株的筛选及其免疫效果评价[J].中国兽医学报，2012，32（7）：997-1000.

[13]卞学兵，曾嘉梅，周继勇，等.免疫鸡群中分离的H9N2亚型禽流感病毒的分子特征研究[J].中国预防兽医学报，2012，34（1）：15-18.

[14]封柯宇，李洪涛，金龙女，等.重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗田间免疫效果观察[J].中国家禽，2011，33（14）：49-50.