降解阿维菌素耐高温菌株AZ11 的分离及降解特性

魏艳丽，李纪顺，扈进冬，张广志，李红梅，杨合同

(山东省科学院生物研究所，山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250014)

阿维菌素(abamectin)是从阿维链霉菌的发酵产物中分离出的一种高效、广谱、低残留生物农药［1-2］。我国阿维菌素原药生产大型企业有7 家，生产能力为800～1 000 吨/年［3］。阿维菌素生产过程中会产生大量废弃药渣，这些药渣中含有丰富的营养成分及未分离完的阿维菌素，无论将其作为肥料还是饲料原料使用，均能从不同方面、不同程度上破坏生态链［4］。从2002年8月份起，国务院、国家最高法院等已开始禁止将抗生素菌渣用作饲料或饲料添加剂，禁止销售不经任何处理、简单加工制成的生物有机肥，如何处理发酵废渣成为亟待解决的问题。

目前国内外对抗生素药渣处理的研究主要集中在青霉素、头孢菌素、四环素等医药类抗生素产品上［5］，在城市生活废水和工业废水中残留抗生素的治理方面研究报道较多，阿维菌素的研究主要集中在残留检测技术［6］和降解动态［7］方面。李荣等［8］从土壤中分离到一株能高效降解阿维菌素的菌株AW70，并将该菌株成功应用于南丰蜜桔中阿维菌素农药污染的修复。有关药渣中残留抗生素降解技术的研究及资源化利用方面还未见报道。

本研究从长期堆放的阿维菌素废渣中筛选到可降解残留阿维菌素的菌株AZ11，该菌株具有较高蛋白酶活性和耐高温特性，可适用于阿维菌素发酵废渣堆肥高温腐熟，为阿维菌素发酵废渣环保处理及其资源化利用提供科学依据，同时也为其它抗生素废渣、废水的综合治理，提供可借鉴的新思路和新方法。

1 材料与方法

1.1 试剂及培养基

阿维菌素标准品购自浙江钱江生化股份有限公司，标样用丙酮配成10 000 mg/L 的溶液。

基础培养基:NH4Cl 1.5 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蛋白胨0.2 g，蒸馏水定容至1 L，pH=7.0。加入一定浓度的阿维菌素作为唯一碳源。

CMC 培养基:羧甲基纤维素10 g，K2HPO48.7 g，柠檬酸2.52 g，琼脂18 g，蒸馏水定容至1 L。

酪素培养基:蛋白胨10 g，葡萄糖1 g，NaCl 5 g，CaCl20.1 g，L-Tyr 0.1 g，酪素5 g，琼脂18 g，蒸馏水定容至1 L。

1.2 样品的采集

发酵废渣样品采自济南澳利新型肥料有限公司，不同堆料部位(深度分别为0～20、20～60 、60～100 cm)取样，每份取样500 g。

1.3 菌株分离纯化

取阿维菌素药渣样品10 g，加入90 mL 无菌水振荡15 min 后，取1 mL 上清加入含阿维菌素50 mg/L 的基础培养基中，分别置于35、45、55℃的培养箱中振荡培养，3 d 为1 周期进行富集，共5 个周期，逐步提高阿维菌素浓度至200 mg/L。将培养液梯度稀释涂布含阿维菌素的基础培养基平板，并分别放置35、45、55℃恒温箱中培养，挑选生长速度快的单菌落进一步分离纯化，直至有单菌落出现。

1.4 高效降解菌的筛选

将分离的单菌落培养后定量接种到含阿维菌素100 mg/L 的基础培养基中振荡培养，设不接菌的处理为对照，每处理重复3 次。分别于接种后6、12、24、48、72 h 取培养液，4℃，10 000 r/min 离心5 min，取上清液2 mL，用HPLC 方法［9］测定阿维菌素含量，计算降解率。

1.5 高效降解菌株耐高温能力测定

将待测菌株接种NA 培养基，分别置于40、50、60℃恒温培养箱中，180 r/min 振荡培养，36 h 后测定OD660。

1.6 高效降解菌株酶活测定方法

采用透明圈法检测高效降解菌株的纤维素酶活性和蛋白酶活性［10］，分别挑取单菌落接种CMC 平板和酪素，培养48 h 后，观察酪蛋白平板菌落周围水解圈的产生情况，CMC 平板用1 mg/mL 刚果红溶液染色20 min，然后用1 mol/L NaOH 退色20 min，并用清水冲洗干净，在日光灯下观察透明圈的大小。

1.7 高效降解菌株的分子生物学鉴定

菌株基因组DNA 提取参照《分子克隆实验指南》［11］，采用CTAB/NaCl 法。利用16 s 通用引物A(5＇-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3＇)和引物B(5＇-TAC GGC TAC CTT GTT ACG-3＇)扩增16s rDNA。纯化的PCR 产物由生Ⅰ生物工程(上海)股份公司测序，结果在Genbank 上利用BLAST 进行比对，利用DNAMAN 分析软件进行比对并绘制系统发育树。

1.8 菌株对阿维菌素的降解特性

将高效降解菌株制成菌悬液，调整菌数为109cfu/mL，向基础盐培养基中添加终浓度为100 mg/L 的阿维菌素标准品，按体积比为1%接种菌悬液，然后分别置于40、50、60℃恒温培养箱内振荡培养，分别设无菌水对照，每个处理设4 次重复。于培养的第0、1、2、3、4 d 取样测定发酵液中阿维菌素的含量。向基础盐培养基中添加不同浓度的阿维菌素标准溶液，测定培养3 d 后溶液OD660值，研究降解菌株对阿维菌素的耐受程度。

图1 降解菌株耐高温能力测定Fig.1 Thermostability determination of the degradation strain

2 结果与分析

2.1 阿维菌素降解菌株的分离

从阿维菌素药渣样品中通过富集培养，共分离到6株能以阿维菌素作为唯一碳源生长的细菌，其中AZ11和AZ12 培养72 h 后的降解率分别为77.6% 和75.3%。菌株AZ11 是从药渣堆的85 cm 处的样品中筛选得到的，取样时该处温度为52℃;AZ12 是从药厂附近的土样中筛选得到的。

2.2 降解菌株耐高温能力测定

将筛选出的降解菌株进行不同温度培养，36 h 后测定OD660，结果如图1 所示，菌株AZ11 在50、60℃培养条件下的生长量明显高于40℃，推测为高温菌。另外两菌株AZ12 和AZ16 的生长状况则正好相反，在40℃下可以生长，但高于50℃时生长量明显降低。

2.3 降解菌株纤维素酶、蛋白酶的活性测定

将分离纯化获得的降解菌株在CMC 培养基上培养2 d 后，经刚果红染色，菌株AZ11、AZ12 均可以产生明显水解圈(图2)，说明具有一定的维素酶活力。接种酪素培养基上培养2 d 后，AZ11 在菌落周围产生明显的蛋白水解透明圈，水解圈直径为9 mm(图3)。

图2 羧甲基纤维素平板活性检测Fig.2 Detection of cellulase activity on the cellulose plate

图3 菌株酪素平板活性检测Fig.3 Detection of protease activity on casein plate

2.4 高效降解菌株AZ11 的分子生物学鉴定

利用16s 通用引物，扩增获得AZ11 菌株的16s rDNA 序列共1 545 bp，经生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将获得的序列在GenBank 中进行Blast 比对，发现与芽孢杆菌属的Geobacillus stearothermophilus 相似性达99.6%，将AZ11 鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。

2.5 高效降解菌株AZ11 对阿维菌素的降解特性

分别于降解菌接种后0、1、2、3、4 d 取样，测定培养液中阿维菌素的浓度。从图4 中可以看出，随着培养时间的延长，降解菌对阿维菌素的降解率保持上升趋势，在2～3 d 期间，菌株的降解率增长较快，3 d 后增长的趋势相对平缓。对照阿维菌素水溶液(100 mg/L)在40、50 和60℃条件下也存在降解现象，4 d 降解率约为3.68%、6.25%和10.17%。

图4 不同温度下菌株AZ11 对阿维菌素的降解率Fig.4 Impact of different fermentation temperatures on abamectin degradation rate

图5 不同浓度阿维菌素对菌株AZ11 生长的影响Fig.5 Impact of different concentrations abamectin on the strain growth

阿维菌素浓度低于800 mg/L 对菌株AZ11 的生长没有明显的影响，浓度大于800 mg/L 时开始影响AZ11 的生长，推测可能产生了高浓度中间代谢产物，抑制了菌株的代谢生长。在低于600 mg/L 时，对菌株生长影响不大，36 h 摇床培养发酵液菌数OD660维持在1.0 左右，表明该菌株适宜于环境中的高浓度阿维菌素残留的降解。

3 讨论

发酵工业副产物(药渣)的处理问题是一个世界性的问题，限制药渣资源化利用的主要“瓶颈”问题是其所残留的抗生素。汤少红等［12］将抗生素药渣直接以肥料的形式用于花卉施用，也取得了较满意的施肥效果，但药渣中残有抗生素，长期使用可能会对土壤微生态平衡产生负面影响。本项目从阿维菌素发酵药渣堆肥中筛选到1 株能高效降解阿维菌素的菌株AZ11，经测定该菌株具有明显的纤维素酶和蛋白酶活性而且属耐高温菌株，通过分子生物学鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，该菌株在低于800 mg/L的阿维菌素浓度的培养基中可正常生长。该菌株可用于阿维菌素发酵废渣固体堆肥中，通过降解阿维菌素残留实现药渣的资源化、无害化利用。

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