鲎试验测定注射用头孢雷特中细菌内毒素的方法学研究

2013-08-29吴帆金钊黄明

四川生理科学杂志 2013年2期

吴帆金钊黄明

（1.四川省达州市通川中医院，四川达州 635000；2.成都中医药大学，四川成都 610097；3.四川省食品药品检验所，四川成都 610097）

细菌内毒素检查是药品一个非常重要的安全指标，输液导致热原超标是输液反应的主要原因［1］，近年来，世界各国越来越多地以细菌内毒素检查法代替家兔热原法检查药品和生物制品的致热物质越来越普遍。注射用头孢雷特临床适应于革兰氏阴性菌引起的肌骨感染、呼吸道感染、尿道感染及心内膜炎等。《中国药典》2010年版尚未收载该品种。为此，特对注射用头孢雷特进行了细菌内毒素的检查。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

注射用头孢雷特（四川抗菌素工业研究所1.0g，批号：090911，090912，090913），细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号：150601-200860，160EU·支-1）；细菌内毒素检查用水（湛江安度斯生物有限公司，批号：0911060）；鲎试剂（湛江安度斯生物制品有限公司，λ=0.5EU· ml-1，批号：0909042），鲎试剂（湛江博康海洋生物有限公司，λ=0.5EU·ml-1，批号：0912210）

1.2 方法

1.2.1 鲎试剂灵敏度（λ）的复核

按照《中国药典》［2］附录规定的方法，对实验所用的鲎试剂（TAL）进行灵敏度复核。结果鲎试剂的实测灵敏度均在0.5～2.0λ之间，符合规定。正式实验时取λ作为鲎试剂的灵敏度。

1.2.2 样品细菌内毒素限值（L）的确定

参照《中国药典》确定样品的细菌内毒素限值（L），L=K·M-1，K 为人用每千克体重每小时最大可接受的细菌内毒素剂量，非放射性药品静脉途径给药时 K 值为5EU·（kg·h-1），M 为人用每千克体重每小时给药最大剂量。注射用头孢雷特成人最大剂量2000 mg·（kg-1·h-1）。综合生产、临床用药和检验的实际情况，将注射用头孢雷特的L值定为0.5EU·mg-1。

1.2.3 样品的干扰试验

用λ=0.5EU·ml-1鲎试剂进行干扰试验时，取1.2.1项下鲎试剂，分别对1批已检测细菌内毒素不超标的样品进行4、2和1 mg·ml-1浓度（批号：09011），进行细菌内毒素干扰试验。样品在表1 所述3 种浓度下，对细菌内毒素检查均无干扰，故正式实验将样品稀释为4mg·ml-1和2mg·ml-1，并取2个厂家灵敏度为0.5EU·ml-1的鲎试剂，参照有关文献［3］按灵敏度复核方法对样品稀释为4mg·ml-1和2mg·ml-1浓度进行干扰实验，并计算以样品稀释液配制的细菌内毒素溶液反应终点浓度的几何均值（Et）及细菌内毒素检查用水配制的内毒素溶液反应终点浓度的几何均值（Es）。

1.2.4 样品中细菌内毒素的常规检查

取上述3批注射用头孢雷特稀释为2mg·ml-1的浓度，以λ=0.5EU·ml-1的鲎试剂，按常规凝胶法进行细菌内毒素检查。

2 结果

注射用头孢雷特稀释为4mg·ml-1和2mg·ml-1浓度进行干扰试验时，其Et与相应的Es均在0.5～2.0之间，且Es在0.5～2.0λ之间，表明此时样品在4mg·ml-1和2mg·ml-1浓度对细菌内毒素检查均无干扰，见表2。上述3批注射用头孢雷特中的细菌内毒素含量均小于0.25EU·mg-1，见表3。

表1 样品的干扰预试验（EU·ml－1）

3 讨论

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测［4］，要求在适宜的温度、pH 值及无干扰作用时鲎试剂能与微量的细菌内毒素反应形成凝胶，通过肉眼观察结果。在建立新药的细菌内毒素检查法时，首先要确定其细菌内毒素限值，还要求至少取3批样品，并应用2个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素的干扰试验，确认样品在某一浓度下不会干扰细菌内毒素检查［2］，本品根据注射用头孢雷特最大临床的规定剂量，确定其细菌内毒素限值为内毒素应小于0.25EU·mg-1，并应用2个厂家鲎试剂对3批注射用头孢雷特样品进行了细菌内毒素检查的干扰试验，结果当样品浓度为2mg·ml-1，对鲎试验检查无干扰作用。从而证实可以建立该品种的细菌内毒素检查法，其细菌内毒素限值应小于0.25EU·mg-1。