Hepcidin对小鼠脑组织中铁沉积及运动行为能力的影响＊

应晓兰 葛力瑜 郝海滨 杨超波 曾文君 申屠杨萍 袁琳波

（1.温州医学院第一临床学院，浙江 温州 325035；2.温州医学院机能中心，浙江 温州 325035；3.温州医学院生理教研室，浙江 温州 325035）

铁是人体最丰富和必要的微量元素，体内的铁按其功能可分为必需与非必需两种。必需铁占体内铁总量的70%，存在于血红蛋白、肌红蛋白、血红素酶类、辅助因子和运输铁中；非必需铁则作为体内的储备铁，主要以铁蛋白和含铁血黄素的形式存在于肝、脾和骨髓等器官组织中。铁由于其独特的化学反应活性，在维持细胞和机体正常代谢过程中起着至关重要的作用，如氧的输送、线粒体的氧化反应、神经递质和DNA 合成等［1-3］。

Hepcidin为最近发现的一种富含半胱氨酸的抗菌多肽。已有研究通过基因敲除和转基因小鼠的研究得到其调控机体铁代谢平衡的直接证据［4］。由此，学者们认为hepcidin很可能就是长期以来人们一直在寻找的存在于小肠、肝脏、骨髓和巨噬细胞之间的可溶性信号物质。它可能通过调节DMT1、Fpn1等铁转运蛋白的表达，抑制十二指肠对铁的吸收及巨噬细胞铁的释放［5］。目前，国内外均罕见hepecidin信号对脑衰老作用机制的报道。本研究旨在探讨脉络丛hepcidin与脑铁代谢和脑衰老之间的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂

右旋糖酐铁注射液（河南省海天药业有限公司，批号：010708），转铁蛋白（Transferrin，Tf）和总铁结合力（Total ironbinding capacity，TIBC）测定试剂盒、ROS检测试剂盒（南京建成生物技术研究所）。

1.2 动物及分组

63只5-6周龄体重为16-20g的清洁级昆明小鼠，由温州医学院实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK （沪）2003-0003）。小鼠按体重随机分为7 组，每组9 只。将右旋糖酐铁注射液配成3 个浓度梯度：2 mg·ml-1、1 mg·ml-1、0.5mg·ml-1；空白对照组隔日大腿肌肉注射0.1 ml生理盐水，铁负荷组隔日大腿肌肉注射不同浓度的右旋糖酐铁注射液0.1ml，hepcidin组先侧脑室注射5μg hepcidin，再注射不同浓度的右旋糖酐铁注射液0.1ml，连续8w，各组动物分笼饲养，自由饮水进食。实验室温度21-25℃，相对湿度40-60%。

1.3 血液指标测定

采用鼠尾刺血法分别在铁负荷的第2、4、6和8w取血，血液在cell-Dyn1700型血细胞计数仪上测定血红蛋白（Hemoglobin，Hb）含量；血清铁（Fe）含量采用AU2700全自动生化仪测定；血清转铁蛋白（Transferrin，Tf）含量和总铁结合力（Total iron-binding capacity，TIBC）的测定严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 脑组织中铁及ROS含量测定

铁负荷及hepcidin 注射8w 后，各组小鼠进行水合氯醛麻醉，并迅速断头取脑，分离大脑皮层、小脑、海马、纹状体、中脑和脑干，分别称重后于-80℃保存备用。取上述组织分别以60℃硝酸（按1∶10稀释）消化48～72h，取100μl消化后组织加2%硝酸1 ml，采用原子吸收光谱法（Atomic absorption spectrophotometry，AAS）测各部分脑组织中铁的含量。ROS含量检测严格按照ROS试剂盒进行。

1.5 Morris水迷宫

Morris水迷宫实验中，保持迷宫外参照物、室内亮度和实验者所处位置固定不变，保持实验室内安静。（1）定位航行实验：实验前将小鼠置于站台上适应20s，然后将小鼠随机从不同象限面壁置入池内，小鼠登上站台5s后终止记录，最长记录时间为60s。若小鼠在60s内不能上台，引导其登上站台适应10s，最后将小鼠擦干放入鼠笼。如此将小鼠置入游泳池，3次为1组，定位航行训练需要完成5组，计平均值。分别测量6组小鼠平均逃逸时间，以评价小鼠的空间学习能力，分别在铁负荷的第2、4、6和8周重复上述步骤。（2）空间探索实验：定位航行1d后撤除水面下的站台，然后将小鼠随机从不同象限内壁置入水池5次，每次记录小鼠在60s内的游泳轨迹并进行分析；同时分别测量小鼠在靶象限内的活动时间，以评判大鼠的空间记忆能力。在第2、4、6和8周重复上述步骤。

1.6 统计学处理

所有数据用表示，采用SPSS14.0软件进行分析，水迷宫数据采用重复测量数据双因素方差分析，其余数据间两两比较采用t检验，P＜0.05被认为有显著性差异。

2 结果

2.1 不同组小鼠血液Hb、血清Fe、Tf含量、TIBC含量测定

与对照组比较，铁负荷小鼠血红蛋白量、血清铁和转铁蛋白含量升高，且呈时间和剂量依赖性（P＜0.05），而血清Tf含量和TIBC降低（P＜0.05）。Hepcidin组血红蛋白量、血清铁和转铁蛋白含量较铁负荷组降低，血清Tf含量和TIBC较铁负荷组升高，见表1。

2.2 脑组织中铁含量

8周末，取小鼠右侧半球大脑、小脑、中脑、脑干、海马和纹状体组织，并行铁含量测定，结果显示，小脑、中脑、海马和纹状体中铁含量明显增加，而hepcidin 明显抑制铁的表达（P＜0.05），见表2。

2.3 脑组织ROS含量

ROS含量检测结果显示，与空白对照组比较，铁负荷小鼠脑组织ROS含量增加（P＜0.05），Hepcidin组较铁负荷组有明显抑制作用，且呈时间和剂量依赖性，见表2。

2.4 Morris水迷宫

定位航行实验结果显示2mg铁负荷第8w 小鼠平均逃逸时间较空白对照组明显增加（P＜0.01）；空间探索实验结果显示，2mg铁负荷8w 小鼠靶象限活动时间较空白对照组明显增加，Hepcidin组较铁负荷组时间明显缩短，见表3。

表1 第8周小鼠血液中Hb、血清Fe、Tf、TIBC含量（ ）

表1 第8周小鼠血液中Hb、血清Fe、Tf、TIBC含量（ ）

注：与对照组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与铁负荷组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表2 第8周小鼠脑组织中铁和ROS含量（ ）

表2 第8周小鼠脑组织中铁和ROS含量（ ）

注：与对照组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与铁负荷组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3 讨论

铁过负荷病因可分为遗传学和获得性的两类。主要的遗传性疾病是遗传性血色病，还有难治性贫血，如重型海洋性贫血，遗传性铁粒幼细胞性贫血。获得性疾病见于一些难治性贫血，再障需输血（可致铁过负荷），长期摄入铁剂。随着铁摄入或输血增多，过量的铁最终超过含铁血黄素沉着症的范围，造成组织明显损害。本实验通过肌注铁剂形成不同铁负荷动物模型，通过血清铁、血红蛋白、脑铁等指标的检测发现小脑，中脑和纹状体中铁和他主要的储存形式铁蛋白含量过度，同时由本实验可见，铁过负荷加速记忆力下降，空间定位能力下降等。因此推测铁过负荷对小鼠小脑，中脑和纹状体造成明显毒性损害。

表3 第8周小鼠运动能力比较（ ）

表3 第8周小鼠运动能力比较（ ）

注：与对照组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与铁负荷组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

通过对铁负荷小鼠脑组织ROS水平检测发现ROS含量增加，且呈时间和剂量依赖性。ROS可通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。机体内的自由基通过其浓度调节着机体细胞的生死平衡。由此我们推测，铁通过影响氧化应激反应产生作用［6］。

Hepcidin可调节小肠铁代谢过程，但hepcidin信号分子在中枢神经系统中有无表达？在脑的哪些区域有表达？如有表达，其具体的作用途径和作用机制又是如何？这些问题目前尚不清楚。在前期实验研究中发现，hepcidin信号分子在脑的广泛区域（包括大脑皮质、海马、间脑、小脑、中脑、脑桥和纹状体）也有高度表达，而且随着动物年龄的增加，大脑皮质、纹状体和海马hepcidin mRNA 表达显著增加［7-8］。通过提取大鼠脉络丛上皮细胞总mRNA 发现，hepcidin mRNA 表达也很高。Hepcidin在脑的广泛区域有表达，说明其对脑铁代谢是有调控作用的，但hepcidin调控脑铁代谢的具体作用途径和作用机制如何？在本实验中，我们采用侧脑室注射hepcidin预处理后进行铁负荷，发现可大大减少脑铁的沉积和减缓运动能力的迟缓现象，证明hepcidin可调控脑铁代谢，在某种程度上可延缓脑衰老。这些问题的解决将为脑铁代谢和脑衰老治疗的研究打开一个新的广阔的领域。今后的研究中我们将从细胞水平进一步研究hepcidin调控的神经细胞铁代谢过程及其机制。

1 郭佩，陈伟斌，张洁.小肠铁释放机制及相关疾病研究进展［J］.生命科学，2008，20（4）：651-656.

2 D′Anna MC，Veuthey TV，Roque ME.Immunolocalization of ferroportin in healthy and anemic mice［J］.J Histochem Cytochem，2009，57（1）：9-16.

3 Feder JN.The hereditary hemochromatosis gene（HFE）：a MHC class I-like gene that functions in the regulation of iron homeostasis［J］.Immunol Res，1999，20（2）：175-185.

4 宋宁，王俊，姜宏.亚铁氧化酶Hephaestin的研究进展［J］.生理科学进展，2007，38（4）：336-338.

5 Finberg KE.Regulation of systemic iron homeostasis［J］.Curr Opin Hematol，2013，20（3）：208-214.

6 Bhattacharyya S，Pal PB，Sil PC.A 35kD Phyllanthus niruri protein modulates iron mediated oxidative impairment to hepatocytes via the inhibition of ERKs，p38 MAPKs and activation of PI3k／Akt pathway［J］.Food Chem Toxicol，2013，19（56）：119-130.

7 Wang SM，Fu LJ，Duan XL.Role of hepcidin in murine brain iron metabolism［J］.Cell Mol Life Sci，2010，67（1）：123-133.

8 付丽娟，段相林，于鹏.铁调素在小鼠脑内的表达及其对膜铁转运蛋白1和二价金属离子转运体1表达的影响［J］.解剖学报，2007，38（3）：253-258.