不同产地生、干、炮姜的UPLC指纹图谱比较研究

韩燕全， 洪 燕， 桂 洁，， 高家荣， 汪永忠， 夏伦祝*

(1.安徽中医学院第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥 230031;2.安徽中医学院，安徽合肥 230031)

生姜为姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鲜根茎，具有解表散寒、化痰止咳、温中止呕、解鱼蟹毒等功效［1］。中医药学自古认为药食同源，姜是最好的范例。早在春秋时期的《论语·乡党》一书中就有孔子“不撤姜食，不多食”的记载。传统医药学认为，姜乃药中佳品，主治风寒感冒、喘咳、呕吐、痰饮、胀满、泄泻等，含姜的方剂和中成药也数目众多。现代医药学也已证明，姜具止呕、强心、抗炎等作用，对感冒、呕吐和咳嗽等疾病有良好的治疗效果，对心脑血管疾病、肿瘤的发生，有一定的防治作用［2］。生姜产地广泛，我国大部分地区均有出产，南方以广东、浙江栽培较为普遍，其次是江西、安徽、四川、云南、湖南、湖北等省;在北方则以山东为主要产地，还有河南、陕西等省栽培较多［3］。众所周知，药材的质量与产地的气候、土壤、阳光、水分等自然条件和生长环境密切相关，这些因素不仅影响着药材的生长发育和分布，而且影响其外部形态、内部构造和生理变异以及有效成分的形成和含有量［4］。目前生姜药材质量控制与品质评价的方法主要侧重于单一或几种成分的定量测定［2］。鉴于此，本实验研究了全国主要产地生、干、炮姜药材的UPLC指纹图谱，为全面评价生、干、炮姜的质量及炮制前后的质量差异提供一定的实验依据。

1 仪器与试药

超高效液相色谱仪 (Waters Acquity H-Class UPLC，美国沃特世公司)包括四元泵、自动进样系统、柱温箱、PDA检测器以及Empower 2工作站;超声仪 (江苏昆山超声仪器有限公司);HFB—200型高速中药粉碎机 (吉首市中州市中药机械厂)，DZF—6050型真空干燥箱 (上海博讯医疗设备厂)，炒药设备 (自制)。

乙腈为色谱纯 (美国TEDIA公司);乙醇、磷酸等试剂均为分析纯;屈臣氏蒸馏水;0.2 μm微孔滤膜 (上海陆纳生物科技有限公司)。对照品批号分别为:姜酮 (122-485)、6-姜酚 (23513-146)、8-姜酚 (23513-088)和 10-姜酚 (23513-157)由上海鼎瑞化工有限公司提供，经1HNMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光谱检测确认其结构 (由上海华东师范大学理工学院物理学系余亦华教授测定);按本方法色谱条件，归一化法测得姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚纯度分别为98.51%、98.79%、98.81%和99.13%。生姜药材购于全国不同省份的原产地，经安徽中医学院第一附属医院韩燕全博士鉴定均为姜科植物姜Zingiber officinaliesRosc的新鲜根茎，采收后按照产地方法埋于潮而不湿的沙土中保存，称量前按《中国药典》2010年版附录Ⅷ项下水分测定法，以甲苯法测定含水率;各产地干姜参考本课题前期研究结果，用晾法制备［5］;各产地炮姜按照《中国药典》2010年版附录“砂烫法”统一制备，生姜样品信息见表1。

表1 17批不同产地生姜样品Tab.1 Seventeen batches samples of fresh ginger from different habitats

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备 精密称定姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚对照品，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液;分别取对照品贮备液各1.0 mL置10 mL量瓶中，作为对照品稀释液;再分别取对照品稀释液1.0、2.5、0.5、1.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得质量浓度为0.042 6、0.087 55、0.013 82、0.034 2 mg/mL的姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 分别精密称取表1中各产地生姜1.25 g左右 (去除含水率，取样量与干姜、炮姜一致)、干姜和炮姜粉末0.25 g左右，置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，超声 (150W，40Hz)25 min，放冷，称量，加甲醇补足失质量，摇匀，0.2 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 生、干、炮姜UPLC指纹图谱方法学考察

2.3.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm);乙腈 (A)-水溶液 (B)为流动相，梯度洗脱［程序为A-B:0～10 min(3∶97);10～15 min(85∶15);15～18 min(100∶0);18～20 min(97∶3)］，检测波长为280 nm，体积流量为0.35 mL/min，柱温为35℃。

2.3.2 精密度试验 取S2(江苏徐州产)干姜的供试品溶液连续进样6次，按2.3.1项下色谱条件测定，以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》(2004版A)评价，相似度结果都在0.99以上，表明仪器的精密度良好。

2.3.3 重现性试验 取同一批S3(山东沂水产)干姜药材，按2.2项下方法平行操作，制备6份供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进行测定，以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》 (2004版A)评价，相似度结果都在0.98以上，表明样品的重现性良好。

2.3.4 稳定性试验 取S1(江西崇仁产)干姜药材按2.2项下制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、24 h分别进样，检测指纹图谱，以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》(2004版A)评价，相似度结果都在0.98以上，表明样品的稳定性良好。

3 结果

3.1 不同产地生、干、炮姜指纹图谱的建立及技术参数

3.1.1 UPLC指纹图谱的建立及共有指纹峰的标定 取不同产地的生、干、炮姜药材，按2.2项下制备样品溶液，在2.3.1项下色谱条件测定样品的指纹图谱。分别得到生、干、炮姜各17批样品图谱。根据中国药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》 (2004版A)处理图谱，通过比较17批供试品UPLC色谱图的检测结果，确定生、干、炮姜的共有指纹峰分别为:16、22、20个，17批不同产地生、干、炮姜药材的特征指纹图谱见图1、2和3。

图1 生姜饮片的UPLC指纹图谱Fig.1 UPLC chromatogram of 17 batches of fresh ginger samples

图2 干姜饮片的UPLC指纹图谱Fig.2 UPLC chromatogram of 17 batches of dried ginger samples

图3 炮姜饮片的UPLC指纹图谱Fig.3 UPLC chromatogram of 17 batches of processed ginger samples

3.1.2 共有峰的相对保留时间及相对峰面积计算生姜的6号、干姜和炮姜的8号色谱峰经对照品定性，鉴定为6-姜酚，其峰面积占总峰面积大于10%，且较稳定，因此选其为参照峰，标为S。分别将各共有色谱峰保留时间与同一图谱中参照峰的保留时间比较，其比值作为各色谱峰的相对保留时间;将各色谱峰峰面积与同一图谱中参照峰的峰面积比较，其比值为各色谱峰的相对峰面积。17批样品中各共有峰相对保留时间RSD＜1.5%，各共有峰相对峰面积RSD＜4.0%，符合指纹图谱的有关规定［6］。

3.2 生、干、炮姜指纹图谱的直观比较 将生、干、炮姜的对照指纹图谱导出，与混合对照品图谱比对，确定部分峰归属并进行直观比较分析。图4中可见生、干、炮姜在a、b、c、d、e和f区域的色谱峰有明显的差异，其中a和c区色谱峰，生姜的紫外吸收较强，而干姜和炮姜均较弱，说明在炮制过程中成分有明显的损失;b区与混合对照品定性比较可确定是姜酮的色谱峰，此峰为炮姜所独有，是干姜在炮制过程中产生的新色谱峰，这与文献报道相一致［8］;而d、e和f区域中，干姜和炮姜的紫外吸收均明显较生姜强，说明在炮制过程中部分成分的量有所增加。直观分析结果可见生、干、炮姜的共有色谱峰差异明显，表明生姜在干燥和砂烫过程中，发生了多种成分的“质”与“量”的变化，这为其药效差异提供了质量方面的证据。

图4 生、干、炮姜对照特征图谱和混合对照品的UPLC色谱图Fig.4 Common UPLC chromatogram of 17 batches of samples and mixed reference substunces

3.3 生、干、炮姜的指纹图谱相似度计算 本实验采用中国药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，分别对不同产地的生、干、炮姜药材的指纹图谱进行相似度分析，相似度评价结果见表2。

表2 不同产地生、干、炮姜相似度计算Tab.2 Similarity evaluation of 17 batches ofsamples

由表2可知，17批生、干、炮姜饮片的指纹图谱各自的相似度均大于0.9，说明不同产地间各批药材相似性较好，其代表性指纹图谱的选择较为合理［7］，生姜、干姜和炮姜的质量差异主要是在炮制过程中产生的。

4 讨论

金元时期著名医家李杲曾云“干姜，生辛炮苦，阳也，生用逐寒邪而发表，炮则除胃冷而守中……”，生姜与其炮制品的药性、药效既有相似之处，又有较明显差异，临床应用也有明显区别。本实验结果表明，17批不同产地生姜的色谱图的整体特征相似，说明不同产地生姜所含的主要成分类别较一致，但是不同产地姜的指纹图谱在非共有峰和特征指纹峰的相对比例、面积上存在一定的差异，说明产地对药材的成分量有一定影响，这可能与产地、生产年限、采收等因素都有一定的关系。由生姜、干姜、炮姜的UPLC指纹图谱可以看出，炮制前后，指纹图谱色谱峰有明显的差异，干姜、炮姜与生姜相比差异主要表现在新色谱峰的增加或原色谱峰的缺失及峰面积的改变;干姜与炮姜相比，共有色谱峰也有明显差异，且炮姜的色谱峰面积较干姜小;由此可以看出，炮制前后，生姜中的成分发生了“质”与“量”两方面的改变，炮制方法的不同对姜的成分含有量也具有明显的影响，这是姜不同炮制品功效和临床应用不同的内在依据。

［1］国家药典委员会.中国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:93.

［2］韩燕全，洪 燕，姜 蕾，等.姜的炮制、质控和药理研究进展［J］.中国现代中药杂志，2011，13(4):50-53.

［3］崔俭杰，李 琼.中国不同产地姜油挥发性成分的对比分析［J］.香料香精化妆品，2011，2(1):1-5.

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［5］韩燕全，左 冬，夏伦祝，等.不同干燥方法和温度对干姜中6、8、10-姜酚含量的影响［J］.中药材，2011，34(10):1152-1154.

［6］董林毅，张庆伟，段宏泉.雷公藤药材HPLC指纹图谱的研究［J］.中国药学杂志，2009，44(6):422-426.

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