紫甘薯的有益成分及其提取纯化方法研究

2013-08-27郭维图

机电信息 2013年23期

郭维图

（东南医药生物工程技术研究所，福建厦门361021）

0 引言

紫甘薯又叫黑薯，薯肉呈紫色至深紫色。紫甘薯中含有丰富的蛋白质和18种易被人体消化和吸收的氨基酸，还富含维生素C、B、A等8种维生素和磷、铁等10多种天然矿物质元素。其中，铁和硒含量丰富，而硒和铁是人体抗疲劳、抗衰老和补血的必要元素，特别是硒被称为“抗癌大王”，易被人体吸收，可留在血清中，修补心肌，增强机体免疫力，清除体内自由基，抑制癌细胞中DNA的合成和癌细胞的分裂与生长，可预防胃癌、肝癌等癌病的发生。紫甘薯富含纤维素，可增加粪便体积，促进肠胃蠕动，清理肠腔内滞留的黏液、积气和腐败物，排出粪便中的有毒物质和致癌物质，保持大便畅通，改善消化道环境，防止胃肠道疾病的发生。

湖北紫鑫生物科技有限公司在黄金山投资建设了目前全国最大的紫甘薯萃取花青素项目。此项粮食深加工项目规划占地53000多m2，总投资1.5亿人民币。一期工程建成后，年处理紫甘薯10000t，年产花青素150t，总产值2亿人民币；二期工程完成后年处理紫甘薯30000t，年产花青素450t，总产值可达10亿人民币。

1 紫甘薯富含花青素

从紫甘薯的颜色就可以判断其含有丰富的花青素。法国科学家马斯魁勒博士发现花青素是天然强效自由基清除剂，可以消除体内自由基，这些自由基是衰老和癌症的元凶。花青素对100多种疾病有预防和治疗作用，被誉为继水、蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质之后的第7大必需营养素。花青素是目前发现的防治疾病、维护人类健康最直接、最有效、最安全的自由基清除剂，其清除自由基的能力是维生素C的20倍、维生素E的50倍。所以，紫甘薯的营养价值要远高于其他薯类。

紫甘薯是甘薯的一个特殊品种类型，因其薯肉富含红色素，作为一种重要天然色素源而引起许多学者的关注。紫甘薯红色素（PSPC）是从紫甘薯的块根和茎叶中浸提出来的一种天然红色素，色泽鲜亮自然，无毒、无特殊气味，具有多种营养、药理和保健功能，是一种理想的天然食用色素资源。

目前，天然着色剂存在的最大问题就是在产品中多数不稳定，因此在一定程度上影响了其在工业中的应用。有资料报道，酰基化的色素分子可以提高色素的稳定性。而紫甘薯色素分子正是酰基化的色素分子，所以其稳定性较强，应用前景广泛。

1.1 花青素的理化性质

原花青素又称为缩合单宁，是自然界中广泛存在的聚多酚类化合物，具有多种生物活性，高效、低毒、生物利用度高，是近年来不断研究开发的一种极强的体内活性功能因子，已广泛应用于食品、药品、化妆品等领域，与原花青素相关的植物学和农学性状的研究、利用和改良正日益受到重视。

花青素分子量为449.2，花青素易溶于水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂。紫甘薯花青素具有较好的热稳定性，在60℃以下稳定性很好，保存率可达到100%。紫甘薯花青素具有较强的耐压特性，在500MPa的压力下处理15min后花青素的保存率仍能保持不变。不同pH值下的紫甘薯的花青素稳定性不同，在较强的酸性条件下（pH≤3），颜色及特征吸收光谱变化不太明显。但在碱性条件下，花青素稳定性较差。花青素是水溶性色素，在酸性中显红色，中性显紫色，碱性显蓝色或绿色不稳定。紫甘薯红色素在不同介质中呈现不同的光谱特性。只有在酸性介质中，波长在530nm处才出现特征吸收峰。

紫甘薯色素对温度和光敏感，高于60℃易于分解，日光、紫外光也能促使其分解，故应避光、阴凉保存。

Fe3+、Cu2+、Al3+离子对紫甘薯色素有较好的增色护色作用，Pb2+离子对紫甘薯色素的稳定性没有影响，Zn2+离子对紫甘薯色素的稳定性影响较大。在针对食品添加剂、氧化剂、还原剂的研究中发现：蔗糖、苯甲酸钠对紫甘薯色素稳定性没有影响；NaNO2对紫甘薯色素破坏性极大；D-异抗坏血酸钠对紫甘薯色素有很好的护色作用。紫甘薯色素对低浓度过氧化氢稳定性较好，对高浓度过氧化氢稳定性较差；Na2SO3对紫甘薯色素的稳定性影响很大，加入Na2SO3会使紫甘薯色素的吸光度急剧下降。

1.2 花青素的用途

1.2.1 花青素的保健功能

花青素通常具有以下保健功能：

1.2.1.1 视力保护者

糖尿病性视网膜病是糖尿病的征兆，它是眼睛毛细血管微出血引起的，是成年盲人的常见病因。花青素可用来防止糖尿病患者在白内障手术后引起的并发症。

1.2.1.2 消除水肿

水肿是血液中的水分、电解质等渗进了人体组织引起的，它通常表现为受伤部位肿胀。坐得过久的健康人会有水肿，妇女月经前会有水肿，运动受伤经常引起水肿，某些手术后可能有水肿，一些疾病也能导致水肿。研究表明，每天服用一次花青素，可以明显缓解水肿现象。

1.2.1.3 皮肤美容

欧洲人称花青素为青春营养品，皮肤维生素，口服化妆品。因为它能恢复胶原蛋白活力，使皮肤平滑而有弹性。胶原蛋白是皮肤的基本成分，并且是一种使身体成为一个整体的胶状物质。维生素C是生化合成胶原蛋白必要的营养品，花青素能使更多的维生素C生效，这意味着，维生素C可以更容易地去完成其所有功能（包括产生胶原蛋白）。花青素连接在胶原蛋白上，可以阻止那些破坏胶原蛋白的酶的危害。花青素不仅可以帮助胶原蛋白纤维形成交联结构，而且可以帮助恢复因受伤和自由基所引起的过度交联的损害。过度交联会使结缔组织窒息和硬化，从而使皮肤起皱纹和过早老化。花青素还可以保护人体免受阳光伤害，防止辐射伤害，促进治愈牛皮癣和寿斑。花青素也是局部施用的皮肤霜的极好添加剂。

1.2.1.4 降低胆固醇

胆固醇是细胞膜的基本组成成分，对于产生和促进脂肪酸的输送来讲，它起了关键作用。但是，过多的胆固醇是一个潜在的危害。花青素和维生素C的组合可以使胆固醇分解，成为胆汁盐，进而排除体外。花青素加快了有害的胆固醇的分解和排除。维生素C和花青素之间的协同关系再一次得到证实。

1.2.1.5 心脏保护剂

花青素不仅能够帮助恢复皮肤弹性，而且也可以帮助关节、动脉以及其他组织（如心脏等）维持正常功能。血管系统负责血液流动，把血液送到所有细胞和组织。因此，不管是从长期和短期效果来看，花青素都是至今发现的最好的心脏保护剂。花青素也可抑制组胺的产生，因而可减轻炎症，帮助动脉抗拒那些引发心血管病的诱变因素的冲击。

1.2.1.6 改善大脑功能

花青素可以帮助增进记忆力，减缓衰老以及中风的风险。甚至在中风发生之后，花青素能帮助改善记忆力和大脑功能，这个事实已被临床研究证明。

1.2.1.7 防止其他疾病

花青素不仅可以帮助减缓心血管发炎，也可帮助治疗许多疾病，例如过敏、气喘、支气管炎、花粉热、类风湿动脉炎、运动受伤、压力溃疡等。人体发炎时要释放出一种名叫组胺的化合物，它可诱发上述疾病的种种症状。花青素抑制产生组胺需要的酶，防止生成组胺，从而减轻发炎。花青素是组胺的著名的抑制剂，但它并不阻碍其他的酶产生。花青素也可防止静脉曲张带来的包括疼痛、瘙痒、烧伤、疲劳等。严重的静脉曲张能引起心脏病、中风、血栓性静脉炎、肺栓塞等。

1.2.2 食品行业中的应用

紫甘薯的红色素耐热性好，主要作为食品的红色至紫红色着色剂而添加到食品中。因属于天然无毒制品，故用量未作限量性规定，以满足所需要的着色度为限。天然植物提取物作为调节身体健康的补充剂已成为时尚。紫甘薯红色素有抗氧化、抗肿瘤等生理作用，因此可以作为保健食品的功能配料来使用。

1.2.3 化妆品行业中的应用

由于紫甘薯红色素具有抗氧化、清除自由基等作用。因此，含紫甘薯红色素的护肤品可抑制由于紫外线照射产生的氧自由基引起过氧化物的生成，对改善皮肤炎症、抗氧化等有一定的作用。此外，它可代替工业中现在使用的合成色素，广泛应用于口红、胭脂、洗发水等化妆品。

2 花青素的提取

花青素的提取是目前花青素研究发展的热点问题，也是花青素生产、投入使用的关键性环节。近年来，在传统提取方法的基础之上，一些凭借新技术或经过改良后的提取方法也开始崭露头角。

2.1 花青素的提取方法

2.1.1 有机溶剂萃取法

这是目前国内外使用最广泛的提取方法。多数选择甲醇、乙酮、丙酮等混合溶剂对材料进行溶解过滤，通过调节溶液酸碱度萃取滤液中的花青素。国内吴信子等用盐酸—甲醇溶液提取，然后用纸层析法（中号）和柱层析法（聚乙酰胺）进行花色苷的分离。

目前，有机溶剂萃取法已成功地应用于诸如葡萄籽、石榴皮、蓝莓等绝大多数含花青素物质的提取分离。有机溶剂萃取法的关键是选择有效溶剂，要求既要对被提取的有效成分有较大溶解度，又要避免大量杂质的溶解。该方法原理简单，对设备要求较低，不足之处是大多数有机溶剂毒副作用大，且产物提取率低。

2.1.2 水溶液提取法

有机溶剂萃取的花青素多有毒性残留，且生产过程环境污染大。鉴于此，水溶液提取法应运而生。该方法一般将植物材料在常压或高压下用热水浸泡，然后用非极性大孔树脂吸附；或直接使用脱氧热水提取，再采用超滤或反渗透，浓缩得到粗提物。此方法是Duncan和Gilmour在1998年发明的提取花青素的方法，设备要求简单，但产品纯度低。

天然色素的提取通常采用在一定温度条件下，在提取罐中对溶剂进行浸泡、沥滤、渗漉等方法。这些常规浸提法具有工艺和提取操作简单、设备投资少、便于生产的优点，但也存在浸提时间长、劳动强度大、原料预处理能耗大、产品质量不太理想（色素溶解性差、色泽变化较大等缺陷），且大量溶剂回收容易导致产品生产成本的提高。

2.1.3 超临界流体萃取法

超临界流体萃取是利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响进行提取。这种方法产品提取率高，但设备成本过高。

孙传经采用超临界CO萃取法对从银杏叶、黑加仑籽及葡萄籽中提取花青素的工艺进行了研究。该工艺中CO和改性剂可循环使用，对环境无污染。

2.1.4 微波提取法

该法于1986年被GanzlertE等人首先用于分离各种类型的化合物。国内李风英探讨了微波技术对葡萄籽中原花青素提取量和分子结构的影响，为微波在葡萄籽中有效成分浸提方面的研究奠定了基础。微波提取法是利用在微波场中，吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到具有较小介电常数、微波吸收能力相对较差的萃取溶剂中。该技术选择性好，萃取率高，速度快，操作简单，废液排放量少。

2.1.5 超声波提取法

超声波提取法在20世纪50年代后逐渐应用于化学化工的生产过程中，且主要集中在植物中药用成分、多糖以及其他功能性成分的提取等研究领域。超声波提取法运用前景好、操作简单、快速高效、生产过程清洁无公害。

2008年，Corrales等人开展的不同提取方法对葡萄中花青素的提取率影响的对比实验结果表明：相同条件下与热浸70℃提取相比，超声波辅助提取花青素等酚类的效率可以提高50%以上。

2.1.6 微生物发酵提取法

此方法将生物发酵技术应用于花青素的提取之中，是生物科学与化工生产之间的超强渗透与有效结合。微生物发酵法利用微生物或酶让含有花青素的细胞壁降解分离，使细胞体内花青素充分溶入到提取液中，从而增加提取的产率与速率。

王振宇采用微生物和纤维素酶降解大花葵细胞壁提取花青素就是可靠的研究实例，该方法的优点是操作稳定性及可靠性高，环境友好。

2.1.7 加压溶剂萃取

加压溶剂萃取法是通过加压提高溶剂的沸点，进而使被提取物在溶剂中的溶解度增加，从而获得较高的萃取效率。

Arapitsas等人在2008年采用了此技术优化了紫甘蓝中花青素的最佳提取工艺。该法的优点是提取率高，但经济成本亦较高。

2.1.8 亚临界水提取技术

亚临界水提取技术是最近几年来的新成果，它的具体做法就是在适度压力下，将水加热到100℃以上，临界温度374℃以下的高温，使水的极性随温度的变化而改变，然后对原材料中的花青素进行提取。

近两年的研究实例有Luque-rodriguez等人采用动态过热流体提取葡萄皮中的花青素，并优化了最佳提取工艺。对比于其他提取方法，亚临界水提取方法清洁、有效、花青素提取量为传统动态固液萃取的3倍，且产品性能更优，不足之处是工艺条件要求较高。

2.1.9 其他提取方法

其他提取方法包括高压脉冲电场辅助提取、双水相萃取、超高压辅助提取。前2种可应用于蛋白质、核酸、多糖的提取研究，而超高压辅助提取已成功应用于葡萄中花青素的提取，且对比发现高压辅助提取花青素等多酚类的效率可以提高近50%。

2.2 试验案例

2.2.1 酸性溶媒法

河北农业大学食品科技学院姚钰蓉等曾研究报道，用甲酸对紫甘薯花青素进行提取的最佳条件为：料液比1:10，提取时间2h，提取剂甲酸浓度5%（v/v），提取温度60℃，提取次数3次，粗提液经AB-8大孔径树脂纯化后，得到色价为20.4的色素纯品。这种方法提取的色素具有较好的耐热、耐压性能。

西南民族大学生命科学与技术学院陈炼红等曾研究报道，采用溶剂提取法提取紫甘薯花青素时，温度为60℃，提取剂中盐酸和乙醇之比为2:3，料液比为1:5，浸提时间是40min，此时是紫薯花青素提取的最佳工艺，超声波处理提高了提取效果。该方法时间短，在保证提取量的前提下，能保护花青素的稳定性，使其在提取时间内不发生变化，保持其有效成分，能够达到实验目的与要求的效果。

花青素易溶于水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂。其中，甲醇不易于食用色素的提取。以水作为提取剂提取效率较低，干燥过程需较高温度。因此，可以选择乙醇作为提取剂。

在本次试验中，有4种因素对花青素提取产生影响，分别是不同盐酸与乙醇的提取剂的影响、温度对提取效果的影响、物料比的影响、提取时间的影响。0.1%的HCl与95%的乙醇之比为重要的影响因素，当0.1%的HCl与95%的乙醇比为40:60时提取效果最好。当酸的含量继续加大时，溶液中色素含量急剧减少。花青素结构中含有酚羟基，有酸性，而其结构中的吡喃杂环上的氧原子为4价，使其具有碱性。

提取剂的pH值过高或过低都会直接影响到色素的提取效果和色素的色调。升温有利于色素的溶出，温度为60℃时提取效果最好，如果继续升高温度，提取效果反而降低。可能是由于紫薯粉中含有一定量的淀粉，加热使其糊化，进而阻止提取剂对色素的溶解，而且长时间处在较高温度下对花青素的稳定性是很不利的。物料比也是一重要的影响，适当增加提取剂的用量有利于色素的溶出，可以提高花青素的浸提率，物料比1:40时浸提效果最好。

紫薯中花青素粗提液在可见分光530nm处有特征吸收峰，属于花青素类物质。

2.2.2 超声波辅助提取法

江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/中国农业科学院甘薯研究所钮福祥、孙健、岳瑞雪、徐飞、朱红等人采用以水、乙醇为介质结合超声波技术对紫甘薯花青素提取工艺进行了研究。结果表明，水提法、乙醇提取法、循环超声波水提法和循环超声波乙醇提取法的最佳提取条件分别为60℃（4h）、40℃（8h）、60℃（1h）、60 ℃（2h），提取率分别为438.0mg/kg、624.1mg/kg、113.0mg/kg、682.6mg/kg，以循环超声波乙醇提取法提取效果最好。对循环超声波乙醇提取法的进一步研究表明，该方法最佳提取条件为提取温度60℃、提取时间2h、提取次数2次、料液比1g:5mL，此时提取率为723.1mg/kg。

湖南化工职业技术学院实训处李忠英采用超声波辅助从紫甘薯中提取色素，以国产紫甘薯为原料，研究醇、有机酸溶液等溶剂提取红色素的条件，考察提取液浓度、料液比、提取次数和浸取时间等因素的影响，通过单因素试验和正交试验确定超声波提取最佳工艺：紫甘薯样品预先浸泡4h，采用柠檬酸浓度10%，料液比1:30，超声功率300W，提取时间25min，提取3次，紫甘薯中红色素提取效果最佳。

2.2.3 微波辅助提取法

浙江万里学院生物与环境学院杨华等选用微波提取方法从紫甘薯中提取花青素，其条件是以宁海紫甘薯粉为原料，研究了紫甘薯色素微波提取的工艺。通过正交实验确定最佳提取工艺参数组合，结果表明最优工艺参数为微波功率700W，微波时间5min，液固比为22.5:1，pH为2.5。在此条件下，测得紫甘薯中花色苷的含量最高为236.3mg/100g。

长春工业大学化学工程学院王道武采用微波提取从紫薯中提取花青素，其条件为以紫薯为原料，在微波条件下萃取其花青素，探讨了微波的辐射时间、温度、液固比、提取剂浓度对紫薯花青素萃取的影响，并采用大孔树脂AB-8纯化提取液，将纯化后的提取液进行反相高效液相色谱分析其成分。实验结果表明，紫薯花青素微波最佳提取条件为：辐射时间60s，温度40℃，液固比40:1，提取剂为1%的HCl、95%乙醇溶液，最佳酸醇比为50:50。

浙江大学化学系蔡吉清等人也采用微波辅助浸提紫色甘薯原花色素，最佳提取条件为：盐酸的50%乙醇溶液，按1:70的料液比，微波处理70s。在此最佳实验条件下，原花青素浸提量为0.96mg/g。此法具有重现性好、污染小、节省时间等优点。

2.2.4 超声波与微波协同法

海南大学食品学院裴志胜等采用超声波与微波协同从紫甘薯中提取花青素，其提取条件为以海南产紫参薯为原料，采用Box-Behnken中心组合试验设计优化紫参薯花青素的超声-微波协同萃取工艺。分别采用时间模式与恒温模式2种方法，在单因素试验基础上，以花青素提取率为响应值，采用三因素三水平的响应面分析法进行试验。结果表明：恒温模式时，在额定超声功率50W、料液比1:48（g/mL）、萃取时间283s、微波控制温度46℃工艺条件下，紫参薯提取率达79.38%，比时间模式下的提取率要高10.63%，超声-微波协同萃取的总花青素质量浓度为48.42mg/L，即4.37mg/g。

2.3 提取方法比较

一般来说，花青素色素的生产工艺主要有：

溶剂萃取法：用含有乙醇的酸性溶液提取后，再经过滤、浓缩等工艺得到最终的产品。

超滤法：将酸性溶液浸提、过滤后的溶液用超滤膜浓缩。

吸附精制法：将酸性溶液浸提、过滤后的溶液用大孔吸附树脂吸附精制后，再浓缩或喷雾干燥得到最终产品。

上述3种方法各有利弊，其中，溶剂萃取法工艺简单，但产品质量不理想，色素纯度低、溶解性差；超滤法产品质量好，但对设备要求高、成本大，提取率低；吸附精制法虽然比溶剂萃取法复杂，但产品的质量高、回收率高。

中国农业大学许正虹采用微波提取试验数据如表1所示。

表1 微波提取与常规提取的比较

综上所述，李瑞丽等考察了微波辅助乙醇浸提法、超声辅助乙醇回流浸提法和乙醇回流浸提3种方法对葡萄籽中的原花青素提取率的影响。结果显示：在原花青素提取率方面，微波辅助法＞超声辅助法＞乙醇回流法；在原花青素纯度方面，微波辅助乙醇浸提法得到的原花青素粗品的纯度较超声辅助乙醇回流法和乙醇回流法的都高。目前，从紫甘薯中提取花青素的方法主要有浸提法、超声波、酶法提取等。

国内学者陆国权等从1996年开始对紫甘薯色素的常规提取、纯化和稳定性进行研究。但是，以上提取方法通常具有时间长、劳动强度大、原料预处理能耗大、热敏性组分易破坏等缺点。微波作为一种新兴的应用技术，近年来在植物化学领域得到广泛应用，它具有穿透力大、选择性强、加热效率高等特点，由于它是一种瞬时穿透式加热方式，在微波场的作用下，植物细胞壁被破坏，从而加快了萃取的速率，有效地提高了产品获得率，尤其是微波连续提取，有利于规模化、产业化生产。因此，本实验首次采用微波条件下萃取紫薯中的花青素的方法，以期改善传统的浸提方法，为进一步开发紫薯功用提供参考。

2.4 影响微波提取的主要因素

2.4.1 提取剂的选择

提取花青素有多种方法，一般使用纯水、无机酸、有机酸、酸的醇溶液为提取剂。在相同条件下，酸化甲醇提取效果最好，但甲醇挥发性强，又有一定毒性，不宜用作天然色素提取剂。稀盐酸和稀柠檬酸提取效果次之，它们对应的产率相近，但柠檬酸作为提取剂时，在微波加热下提取效果较差。由于介电常数大的体系更适宜于用微波处理，而盐酸的介电常数大于柠檬酸，所以，以柠檬酸作为提取剂的效果较明显。本实验体系选用盐酸的乙醇溶液作为提取液。

2.4.2 乙醇体积分数的确定

在微波处理条件下，乙醇的浸提效果优于纯水溶剂。以50%的乙醇浸提原花青素量最高，因为乙醇对原花青素的溶解度比水大，在浸泡过程中，乙醇等有机溶剂对细胞的破坏作用也比水强，在微波场中这种差异更加明显。

2.4.3 料液比的确定

按实验方法，取1g:40mL、1g:50mL、1g:60mL、1g:70mL、1g:80mL、1g:90mL、1g:100mL 的料液比加入体积分数50%的乙醇。随着料液比的增大，原花青素浸提量逐渐增大，但到一定程度时，浸提量会有所下降，最佳料液比为1:70。这是由于大量溶剂吸收了微波致使提取温度降低导致的。

2.4.4 微波处理功率与时间的确定

微波处理时间加长，加速了紫甘薯原花青素的浸提。但是，随着时间的增加，微波的高效加热使提取剂温度迅速接近使花青素易分解的温度（70～80℃）。目前花青素的各种提取方法，提取温度均控制在45℃以下。微波处理70s后，提取液温度略高于70℃。如果微波处理超过70s，糊化现象出现机率增高，导致提取剂和废渣难以通过抽滤分离，浸提量反而下降，这可能是随着微波处理时间的延长，使料液温度增高，低聚原花青素被破坏。因此，确定微波处理时间宜为70s。

3 花青素的纯化

色素纯化的主要方法、色素粗提物的纯化方法应根据色素化学成分、主要杂质成分来进行选择，常用的方法有：柱层析法、膜分离法、溶剂分级沉淀法、两相萃取法、酶法和结晶法等。试验室小样的分离纯化常采用两相萃取法、大孔树脂吸附法、凝胶柱层析法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法等。其中，纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法兼具分离、定性定量分析检测等用途。

工业化生产中常用的纯化方法主要有柱层析法、两相萃取法、膜分离法和溶剂分级沉淀法等。其中，柱层析法因分离效果好、成本低、操作简便、易于大规模生产而被广泛采用，是最具发展前景的色素纯化方法。柱层析法是应用最为广泛的一类色素纯化技术，其基本原理是利用混合物各组成部分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同或其他作用性能的差异，使混合物的溶液流经固定相时，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。根据固定相的不同，柱层析分离可分为许多种类，早期的固定相主要是氧化铝和纤维素等，目前常采用大孔树脂、离子交换树脂、凝胶、硅胶等。

3.1 花青素的纯化方法

3.1.1 大孔树脂吸附层析

大孔吸附树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材料，是近10年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，其吸附实质是表面分子因受作用力不均等而产生的表面吸附现象，这种吸附作用是由于范德华引力或生成氢键的结果，同时由于大孔吸附树脂的多孔结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用。通过这种吸附和筛选，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，经一定溶剂洗脱而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。一般来说，对非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强；对极性大孔树脂和极性较大的化合物，则用极性强的溶剂能更好地实现分离。

王华等人采用AmberliteXAD-7HP大孔吸附树脂对葡萄果皮花色苷的纯化进行了研究，确定的最优工艺条件为：色素溶液浓度1.2mg/mL，吸附时间60min，吸附流速1.5BV/h，pH值2.0，5%甲酸甲醇为解析剂，动态洗脱流速1.5BV/h；优化条件下所得产品的纯度可达90.05%。

尹忠平等人以X-5树脂对玫瑰茄红粗提色素进行了纯化，纯化后色素色价从5.1提高到了32.2，树脂经8次重复使用，吸附性能无明显减弱，可以循环使用。

上官新晨等人以X-5树脂纯化紫红薯色素，确定了上柱液pH值、吸附流速、解吸液、解吸液流速等优化工艺条件，为紫红薯色素工业化纯化生产提供了理论依据。

陈美红等人选用NKA大孔树脂对桑甚红色素进行纯化，优化了纯化工艺，树脂重复使用8次后吸附率仅降低2.8%，经纯化后的色素为紫黑色粉末，其色价为452，是未纯化的48.7倍。

王锋等人以HP-20型大孔树脂对黑花生衣色素进行了纯化研究，优化了上柱量、上样液pH值、上样花色苷浓度、吸附温度、洗脱剂等工艺参数，经纯化色素的纯度提高1倍。

党蕊叶等人以X-5树脂纯化矮牵牛花红色素、何志伟等人以D-101树脂纯化乌饭树果色素、唐纯翼等人以HPD-600树脂纯化爬山虎红色素均取得了较好的分离纯化效果和较高的回收率。

总体来看，大孔树脂具有物理化学稳定性高、吸附选择性强、不受无机物存在的影响、再生简便、解析条件温和、使用周期长、易于构成闭路循环、可循环使用、节省费用等优点，避免了有机溶剂提取分离造成的有机溶剂回收难、损耗大、成本高、易燃易爆以及对环境造成污染等缺点。因此，大孔树脂广泛应用于天然产物的分离。

3.1.2 离子交换树脂层析

离子交换柱层析是以离子交换树脂为固定相的层析分离方法，该方法使得固载在聚合物骨架上的功能基团所带的可交换的离子在溶液中能发生解离，且可在较大的范围内自由移动并扩散到溶液中，而溶液中的同类型离子也能从溶液中扩散到聚合物的网络和孔内，当这2种离子的浓度差较大时，就产生一种交换的推动力使它们之间发生交换作用，浓度差越大，交换速度越快，利用这种浓度差的推动力使树脂上的可交换离子发生可逆交换反应。

离子交换树脂层析技术设备简单、操作方便、生产连续化程度高，而且得到的产品往往纯度高，同时成本低廉。因此，在天然产物提取分离研究与生产中的应用将日益广泛。离子交换树脂不仅用于水处理，而且广泛应用于天然产物的分离纯化，在天然色素的纯化中有着广泛的应用。由于花青素类色素是水溶性的，通常多以水或乙醇水溶液为提取液，因而粗提物中常见的杂质是多糖类、蛋白质类、有机酸类等，色素的纯化就是要除去这些杂质。离子交换树脂可除去糖、有机酸、无机盐等，并可提高精制后色素的稳定性，因而常用于纯化虎杖黄色素、葡萄皮色素等花青素类色素。

钟瑞敏等人以弱酸性阳离子树脂D152纯化葡萄花色苷，结果表明吸附率超过95%，而且95%的乙醇洗脱速度较快、洗脱率高。

3.1.3 凝胶层析

凝胶层析也称排阻层析，其工作原理是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析分离的固定相一般为交联的多聚糖（如葡聚糖或琼脂糖），小分子物质能进入其内部，洗脱下来的速度慢，而大分子物质被排除在外部，洗脱下来的速度快，当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。凝胶柱层析的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且所要分离成分的理化性质能得到较好的保持。

Andersen等人用AmberliteXAD-7、SephadexLH-20对草莓花色苷的粗提物进行层析分离，HPLC验证结果表明纯化的效果很好。以X-5等大孔树脂进行纯化，再以SephadexG-50等进行凝胶柱层析精制，可获得高色价色素。研究表明，凝胶层析对原花青素也有较好的纯化效果。

3.1.4 硅胶柱层析

硅胶是一种常用的极性吸附剂，可作为分配层析中的支持剂，其吸附作用的强弱与硅醇基含量多少有关，主要优点是具有惰性、吸附量大和容易制备成各种类型的硅胶。硅胶柱层析是利用有机物各组分对同一吸附剂吸附能力的差异，并在流动相作用下不断进行吸附和解吸，最终达到分离的目的。由于硅胶层析法操作简单、成本低、分离效果好，已在花色苷的纯化中得到了广泛应用。

王霞等人采用硅胶层析技术对黑甜玉米黑色素进行了提取及纯化工艺研究，结果表明纯化后色素的纯度显著提高。

徐忠等人利用硅胶层析对千日红花色苷酶法提取后的粗色素进行了分离纯化，并研究径长比和层析柱温度2个因素对纯化效果的影响，结果表明径长比1:30、层析温度35℃条件下纯化效果较好。

3.1.5 膜分离法

膜分离技术是一种新兴的高效分离技术，是以高分子膜为代表的一种新型的流体分离单元操作技术。该技术利用具有选择透过性膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（如压力差、浓度差、电位差等）时，物料依据滤膜孔径的大小而通过或被截留，达到分离、提纯的目的。花青素类色素分离纯化中常用的膜分离技术有超滤（UF）、反渗透（RO）、电渗析（ED）等。在花青素类粗提色素中，常夹杂着多糖、鞣质等大分子物质，膜分离可利用于选择透过性膜将其去除，此外膜分离也可以除去铅、砷、铜、汞等金属离子，从而提高色价及稳定性。膜分离在常温进行，条件温和，能较好地保持色素的稳定性及其生理活性，且操作简便，因而引起了科研人员和色素生产企业的广泛关注。

Patil以酸化的乙醇提取红萝卜花色苷，再以膜分离的方法进行脱醇和浓缩提取液，花色苷的含量从372.6mg/L提高到625.8mg/L，再以渗透膜联合蒸馏的方法浓缩至4850mg/L。

Lin等人以电渗析的方法从废弃的紫苏盐水溶液中回收色素，除去了其中90%质量分数的NaCl，并回收了86%质量分数的紫苏花色苷。

从已有的研究资料来看，膜分离纯化的花色苷色价和透明度高，稳定性好，容易实现连续化生产，流程简单，但对设备要求高，纯化成本较高，色素回收率较低。

3.1.6 溶剂分级沉淀法

溶剂分级沉淀法纯化色素主要是利用乙醇来进行，其原理是：多次反复调整乙醇浓度使大分子物质，如多糖、淀粉和蛋白质等物质沉淀，去除沉淀可得到较纯的花色苷溶液。但从实际应用情况来看，此法操作过程繁琐，且需消耗大量的乙醇，乙醇回收量大，且沉淀过程伴有色素的吸附和包夹，色素损失较大、回收率低。因此，该法在花色苷分离纯化实际生产中应用较少。

3.1.7 两相萃取法

该法利用色素与杂质在两相溶剂中分配系数的不同而加以分离。色素水提取液中存在的脂溶性杂质，可用亲脂性溶剂如石油醚、正已烷等将其除去。提取黄酮类色素时多采用乙酸乙酯-水两相萃取，提取亲水性强的苷类色素时则采用正丁醇-水两相萃取。为了提高分离效果，也可采用逆流连续萃取和逆流分配方法。

3.1.8 酶法

酶是具有专一性的高效催化剂，其催化作用多在常温、近中性的条件下进行，特别适合耐热性不强的天然色素的精制。酶精制法主要是利用酶的专一催化分解作用除去杂质，如在粗提色素溶液中加入适量的果胶酶、蛋白酶、多酚氧化酶等，果胶和蛋白质类等物质能提高色素纯度。虽然此法有其专一性等特点，但需要和其他方法联用才能达到更好的分离和纯化效果。据报道，在35℃、pH值4.7的条件下以多酚氧化酶处理花生衣，然后以酸碱处理制取色素，可获得较好的纯化效果。

3.1.9 醋酸盐沉淀法

向色素溶液中加入质量分数5%的醋酸铅，可使其中的色素沉淀，过滤收集沉淀，再用盐酸酸化的乙醇溶解，可形成氯化铅白色沉淀，过滤除去白色氧化铅沉淀即可得到纯度较高的花色苷溶液。

Apsalis等人曾以醋酸铅沉淀法和离子交换树脂法纯化花色苷，获得了纯度较高的色素。由于醋酸铅有剧毒，该法有醋酸铅残留的可能，因此该法不适用于食用天然色素的生产。

3.2 纯化新技术应用案例

3.2.1 大孔径树脂层析分离技术

长春工业大学化学工程学院王道武采用AB-8大孔树脂吸附紫薯色素，将吸附色素的大孔树脂用一定量的95%乙醇解析。称取20.0g干态AB-8大孔树脂，用95%乙醇浸泡2h，装入直径1.5cm×30cm玻璃色谱柱，压实。将装好的柱子用2～3倍树脂床体积的蒸馏水洗柱，待柱子稳定以后，将适量的花青素提取液以1.0mL/min上柱。用蒸馏水为流动相进行吸附，直至用Molish试剂检测不含糖，再用95%的乙醇溶液，以1.0mL/min的流速进行洗脱，在波长280nm处检测，收集出峰开始到出峰结束时的洗脱液，将洗脱液合并，经旋转蒸发浓缩和烘箱干燥得到粉末样品，收集后避光保存。

河北农业大学食品科技学院姚钰蓉等也采用AB-8大孔树脂对花青素粗提液进行纯化。通过静态吸附、解吸和动态吸附、解吸等试验来考察AB-8大孔树脂的纯化性能。结果显示：AB-8大孔树脂对紫甘薯花青素具有较强的吸附能力，其饱和吸附量为0.06g/mL湿树脂。pH值在1.0～3.0范围内对树脂吸附效果的影响差异不显著。乙醇浓度对解吸效果有影响，70%的乙醇水溶液解吸效果最好。

3.2.2 膜分离技术

膜分离技术是利用膜孔径大小特征在常温下对溶质和溶剂进行分离达到纯化目的，研究表明膜分离技术在中草药分离纯化中的应用主要有3大功能，即截留大分子杂质、滤除小分子物质和脱水浓缩。花青素的分子量449.2，而淀粉是紫薯提取中夹杂在花青素提取液中的大量杂质，淀粉的分子量在50000～500000之间，如果先选用截留分子量50000的微孔膜进行截留，然后再用10000的超滤膜进行分离，最后用反渗透或超滤膜进行浓缩，使水透过膜，这样可获得色价较高的花青素。尤其是花青素在高于60℃的条件下容易分解，采用相变的蒸汽加热浓缩方法，色素损失相当大。因此，采用膜分离浓缩是最佳的选择。