慢性乙肝患者血清HBV cccDNA检测的临床意义

杨彩娥，黄丽琴，孙 彬，何菊芳，韩 冰

1解放军第309医院 检验科，北京 100091；2河北北方学院，河北张家口 075000

目前慢性乙肝的实验室检查常采用免疫学指标HBeAg、HBV DNA反映病毒复制情况，其特异性好但灵敏度相对较低；采用生化指标ALT、AST、TBIL反映肝细胞损伤程度，其灵敏度好但特异性相对较差。共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的模板，可长期存在于细胞核中，是HBV持续感染的关键，也是乙肝慢性化的主要原因[1-2]。当肝细胞变性坏死时，肝细胞核内的cccDNA可释放入血。有研究表明血清cccDNA与肝内cccDNA有非常好的相关性[3]，且血清cccDNA可反映肝细胞损伤的严重程度。本文通过对58例慢性乙型肝炎患者血清HBV cccDNA与现有血清学指标的相关性分析，探讨其在慢性乙肝患者病毒复制和肝细胞损伤评价中的意义。

材料和方法

1 标本采集及保存 标本来自解放军第309医院2009年5月-2012年5月58例门诊和住院慢性乙肝患者，其中男48例，女10例。年龄18~80岁，平均46.25岁。诊断符合2010年修订的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]，排除甲、丙、丁、戊型肝炎和其他原因所致的肝损害。依据肝组织切片的病理组织学结果将肝组织炎症分为轻度(G1-2)、中度至重度(G3-4)。诊断标准见《病毒性肝炎防治方案》[5]。抽取患者空腹静脉血5 ml，待完全凝固后3 000 r/min离心10 min，分离血清置-80℃冰箱保存。

2 主要仪器与试剂 1)仪器：德国艾本德股份公司(Eppendorf)的Mastercycler ep realplex实时荧光定量PCR仪，罗氏公司的C6000免疫分析仪，日立Hi7600全自动生化分析仪。2)试剂：北京索奥生物医药科技有限公司的乙型肝炎病毒cccDNA核酸扩增检测试剂盒检测HBV cccDNA；上海复兴公司的乙肝病毒核酸定量检测试剂盒(PCR－荧光探针法)检测HBV DNA；上海罗氏诊断产品有限公司的乙型肝炎病毒HBeAg检测试剂盒(电化学发光法)检测HBeAg；北京莱帮生物技术有限公司测定试剂盒检测AST、ALT、TBIL。

3 HBV cccDNA的试剂准备 从试剂盒中取出HBV-cPCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀。按样本数(血清标本+阴性对照+阳性对照+标准品)n取HBV cccDNA PCR反应液n×24μl、Taq酶n×2μl，充分混匀，10 000 r/min离心10 s。按每管26μl加入0.2 ml离心反应管中。

4 HBV DNA的试剂准备 从试剂盒中取出HBVPCR缓冲液、Taq酶系、荧光探针、MgCl2。室温融化并振荡混匀10 s。按样本数(血清标本+阴性对照+阳性对照+标准品)N取HBV PCR反应液n×18μl、Taq 酶 n×2μl、荧光探针 n×3μl、MgCl2n×3μl，充分混匀，10 000 r/min离心10 s。按每管26μl加入0.2 ml离心反应管中。

5 模板的提取 取50μl待检血清标本(冻存血清使用前在室温融解，并充分混匀)分别加入50μl核酸提取液A，振荡混匀10 s，13 000 r/min离心10 min。弃去上清95μl，分别加50μl核酸提取液B至沉淀中，振荡混匀10 s，100℃恒温10 min，13 000 r/min离心3 min，上清即为模板。

6 HBV cccDNA标准品的配制 HBV-c阳性定量标准品用阴性质控品梯度稀释10倍、100倍、1 000倍，记为1×106Copies/ml，1×105Copies/ml，1×104Copies/ml的标准品。

7 标本加样 HBV cccDNA和HBV DNA各自的模板、阴性对照、阳性对照、标准品各4μl加入反应管中，置全自动定量PCR仪上进行反应。

8 PCR扩增 1) HBV cccDNA PCR扩增：取PCR反应管按顺序放入PCR扩增仪中，按下面的程序设定反应条件：93℃ 2 min，然后94℃ 5 s→55℃ 45 s，共40个循环。2) HBV DNA PCR扩增：取PCR反应管按顺序放入PCR扩增仪中，按下面的程序设定反应条件94℃ 5 s→60℃ 40 s，共40个循环。3)结果分析：以高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。4)质量控制：试剂质量完好并操作正确，阳性对照应检测为相应的范围，阴性对照应表现为阴性结果。5)结果检测：采用Mastercycler ep realplex专用软件分析。

9 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件进行数据处理。HBV DNA与HBV cccDNA定量值取对数变换后，符合正态分布，二者相关性采用直线相关分析；计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 血清HBV cccDNA与ALT，AST和TBIL的相关性Tab.1 Correlation between serum HBV cccDNA and ALT, AST, TBIL(n, %)

结 果

1 血清HBV cccDNA与HBV DNA的相关性 慢性乙肝患者血清HBV cccDNA定量与血清HBV DNA定量呈正相关，见图1。

图1 血清HBV cccDNA与HBV DNA的相关性(r=0.880， P=0.000)Fig.1 Correlation between serum HBV cccDNA and HBV DNA(r=0.880， P=0.000)

2 血清HBV cccDNA与HBeAg的相关性 34例HBeAg阳性患者中有23例HBV cccDNA阳性，阳性比例达67.6%；24例HBeAg阴性患者中仅有9例HBV cccDNA阳性，阳性比例为37.5%。统计学分析显示HBeAg阳性组HBV cccDNA阳性的比例高于HBeAg阴性组(χ2=5.170，P=0.023)。

3 血清HBV cccDNA与肝功能异常 肝功能异常以AST、ALT大于正常范围的1.5倍、TBIL≥22μmol/l为标准。HBV cccDNA阳性、阴性者发生肝功能异常的比例无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

4 血清HBV cccDNA与肝组织炎症程度 23例轻度炎症患者中有13例HBV cccDNA阳性，阳性比例为56.5%；35例中至重度炎症患者中有29例HBV cccDNA阳性，阳性比例达82.9%，高于轻度炎症组 (χ2=4.819，P=0.028)。

讨 论

HBV cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始合成模板，对于乙肝病毒复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。HBV cccDNA主要存在于宿主肝细胞核内，传统检测方法是肝穿刺活组织检查，患者不易接受，取材困难，临床应用受到极大限制。近年的研究表明乙肝患者血清中可检测到HBV cccDNA，大多来源于受损的肝组织，一定程度可反映肝内cccDNA的水平[3]。随着PCR技术的逐步发展，血清HBV cccDNA的定量检测在临床上得到越来越广泛的应用。

本研究采用PCR方法结合Taqman荧光探针技术定量检测血清HBV cccDNA，58例慢性乙肝患者血清中32例检出cccDNA，其中HBeAg阳性组cccDNA阳性率达67.6%，高于HBeAg阴性组，与相关报道一致[6]。直线相关分析也显示血清cccDNA载量与血清HBV DNA载量有很好的相关性，说明血清cccDNA是临床判断病毒复制的良好指标。此外，同一样本中血清HBV DNA均高于cccDNA，可能因为血清HBV DNA是总DNA，包括cccDNA和基因组DNA，cccDNA只是HBV DNA的一部分。

从理论上推测，当肝组织处于炎症活动阶段时，存在于肝细胞核内的HBV cccDNA，在肝细胞变性、坏死时也可以同转氨酶一样释放到血液中，而且肝细胞损伤越严重，血液中的HBV cccDNA水平也越高[7-8]。本研究发现，82.9%的中至重度肝损伤患者血清HBV cccDNA呈阳性，高于轻度损伤者，说明血清HBV cccDNA与肝细胞损伤的严重程度相关，与相关报道一致[9-10]。本研究还调查了血清HBV cccDNA与肝功能异常的关系，统计学分析显示HBV cccDNA阳性、阴性者发生肝功能异常的比例无统计学意义，可能因为HBV cccDNA升高先于ALT，在ALT升高之前，HBV cccDNA和HBV DNA就能够达到检出水平[7]。

1 姜友珍．乙型肝炎病毒cccDNA的研究进展［J］.中国自然医学杂志，2010，12（3）：231-232．

2 唐丽，陈瑞琳．慢性乙型肝炎病毒感染者检测血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的临床意义［J］.华西医学，2010，25（2）：331-332．

3 覃亚勤，赵登蕴，刘彦慧，等．慢性HBV感染患者血清cccDNA与HBVDNA、HBeAg关系研究［J］.中国实验诊断学，2009，13（9）：1193-1195．

4 中华医学会肝病学分会与中华医学会感染病学分会．慢性乙型肝炎防治指南（2010版）［J］.临床肝胆病杂志， 2011， 27（S1）：1-16.

5 中华医学会传染病与寄生虫病学分会， 肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案［J］.中华肝脏病杂志，2000，8（6）：324-329.

6 Wong DK， Yuen MF， Yuan H， et al. Quantitation of covalently closed circular hepatitis B virus DNA in chronic hepatitis B patients［J］. Hepatology， 2004， 40（3）： 727-737.

7 Chen Y， Sze J， He ML. HBV cccDNA in patients' sera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of liver damage［J］. World J Gastroenterol， 2004， 10（1）： 82-85.

8 李红，唐红．乙肝病毒cccDNA检测方法及临床意义的研究进展［J］.生物医学工程学杂志，2009，26（3）：662-666．

9 凌勇武，吴月平，王世蓬，等. 抗病毒治疗后慢性乙肝患者HBVcccDNA检测临床价值分析［J］.南通大学学报（医学版），2008，28（4）：297-298.

10 马艳丽，任万华，主余华，等. 定量检测乙型肝炎病毒cccDNA的临床意义［J］.临床检验杂志，2006，24（1）：48.