临床细菌多重耐药机制研究进展及对策

董 梅 综述 匡铁吉 审校

解放军第309医院 检验科，北京 100091

［组稿专家简介］ 董梅，解放军第309医院医学检验中心主任，主任医师，硕士生导师。现任全军检验医学专业委员会委员、全军检验医学专业免疫分委会副主任委员、总参血液管理学专业委员会主任委员、总参基础医学与检验医学专业委员会副主任委员。近5年承担国家自然科学基金课题、国家“十一五”科技支撑计划子课题、国家重大传染病专项等多项课题，从事细菌耐药和免疫学研究10余年，获军队科技进步三等奖3项、中华科技进步三等奖1项，华夏科技二等奖1项。发表论文40余篇， SCI 5篇，主编专著2部。

随着抗生素的大量应用，特别是无指征用药、不恰当地选择备用抗菌药、过度治疗及频繁换药，导致耐药率越来越高，耐药程度越来越严重[1]。自发耐药突变的存在与抗生素选择压力的持续作用，病原菌环境适应能力与人体微环境生态变化的进化催动，是临床耐药菌和多重耐药菌产生的基础。多重耐药菌，广义上也包括广泛耐药菌或超级细菌，其产生和发展给临床诊治带来巨大挑战。研究多重耐药菌的耐药机制，有利于发现新的药物作用靶点，对研究抗菌新药，对临床制定合理的治疗方案，对制定多重耐药菌感染与传播预防策略有重要意义。

1 临床常见多耐药机制

1.1 超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)产生菌 超广谱β-内酰胺酶： 产生β-内酰胺酶是细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因，β-内酰胺酶通过丝氨酸活性位点与β-内酰胺类抗菌药物分子中酰胺环结合并打开β-内酰胺环，导致药物失活。驱动ESBLs进化的选择压力通常归因于β-内酰胺类、奎诺酮类等药物的使用强度，β-内酰胺类药物可促使ESBLs基因拷贝数增加而导致细菌高产ESBLs，同种属和不同种属的细菌通过接合、传导、转化、转座等方式获得耐药基因，导致更多细菌产生ESBLs。已发现ESBLs超过300余种，根据编码基因同源性的不同分为TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA和其他5类。国内以CTX-M型为主，产ESBLs细菌的耐药基因质粒不仅可以通过垂直传播，而且可以水平传播，通过多种耐药基因在细菌的质粒上群聚，致使细菌产生多重耐药性[2-3]。一般ESBLs由临床占首位的肠杆菌科细菌产生，其中以大肠杆菌为主，其次为肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌等，ESBLs的产生使抗感染治疗更为困难，抗菌药物选择更窄。

1.2 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA) 金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，医院医师和护士鼻腔带菌达到80%~100%，而且常为耐药菌，是医院感染的重要因素。MRSA定义为携带mecA基因或表达青霉素结合蛋白2a(penicillin-binding protein 2a，PBP2a)，通常呈多重耐药菌(multidrug resistance bacteria，MDR)，对氨基糖甙类、大环内酯类、四环素类耐药。MRSA主要耐药机制有两种： 1)由于染色体DNA介导的固有耐药性，主要是由于MRSA存在mecA基因，其编码产生一种特殊的青霉素结合蛋白(PBP2a)，对β-内酰胺类抗菌药物亲和力降低而产生耐药性； 2)由于质粒介导产生β-内酰胺酶而获得耐药、来源为DNA的转导、转化或其他类型的DNA插入，β-内酰胺酶可使β-内酰胺类抗生素失去活性，从而导致耐药[4]。

1.3 耐万古霉素的肠球菌(vancomycin resistant enterococci，VRE) 耐万古霉素的肠球菌通过改变五肽聚糖前体而使万古霉素不能与改变了的肽聚糖交联靶位点(D-Ala-D-lactate)结合，从而阻止了万古霉素对细胞壁合成的抑制，肽聚糖交联靶位点改变导致万古霉素耐药。临床上的VRE常引起严重感染，治疗极为困难。肠球菌耐药愈来愈广，表现为高水平的耐青霉素、耐氨基糖甙类和耐万古霉素，以及对头孢菌素、克林霉素、磺胺天然耐药。目前，由于质粒、转座子及突变株的产生，肠球菌又对四环素、氯霉素、奎诺酮产生耐药性。其耐药机制是耐药基因播散，细菌获得耐药基因，细菌细胞壁上的D-丙氨酸-D-丙氨酸二肽被D-丙氨酸-D-赖氨酸或D-丙氨酸-D-色氨酸取代，与万古霉素的亲和力降低表现为耐药[5-6]。肠球菌属可通过宿主质粒在肠球菌和其他G+球菌(如金黄色葡萄球菌、链球菌属)之间转移耐药基因，存在将万古霉素的耐药性传递给毒力更强的细菌的危险。

1.4 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(包括NDM-1基因携带菌)碳青霉烯酶是指所有明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类的一类β-内酰胺酶，分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶。其中A类酶为丝氨酸酶，见于一些肠杆菌科细菌； B类为金属酶，由染色体、质粒或转座子介导，产金属酶的细菌包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌。带有NDM-1基因的细菌，能水解β-内酰胺类抗菌药物(如青霉素G、氨苄西林、甲氧西林、头孢类等抗生素)，因而对这些广谱抗生素具有耐药性[7]。发现带有NDM-1的细菌主要为大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、摩氏摩根菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌等[8-9]。带有NDM-1基因的细菌对临床常用的大多数抗生素都耐药，如： 亚胺培南、美罗培南、氧哌嗪青霉素-他唑巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、头孢匹罗、氨曲南、环丙沙星、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、米诺四环素等。由于产金属酶的细菌均具有广泛耐药性，已成为临床抗感染治疗、特别是革兰氏阴性菌感染治疗的难点，也是细菌耐药与传播机制研究的挑战[10]。

细菌的能量依赖性主动转运机制，能将已经进入细菌体内的抗生素泵出体外； 降低抗生素吸收速率或改变了转运途径，也导致耐药性的产生[11]。RND家族、MFS超家族和APC超家族是目前细菌膜外排泵系统的主要研究热点[12]。此外，靶位蛋白的改变、外膜孔蛋白的缺失与改变、产生修饰酶，均与细菌耐药性有关。

1.5 多重耐药结核分枝杆菌(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB) 近年来不断上升的耐多药结核病人，为结核病的控制工作带来严峻挑战，据WHO估计每年全球被MDR结核菌感染的肺结核患者至少50万。MDR是指至少对利福平和异烟肼两种主要抗结核药物耐药的结核菌。与普通结核病相比，针对MDR-TB的治疗需要引入二线抗结核药物，治疗成本大幅提高，时间更长，并且产生更多的不良反应。其耐药机制主要是基因突变，多数学者认为因结核分枝杆菌不存在质粒，无法通过质粒介导而获得耐药性，因此染色体介导产生的耐药性是MDR-TB产生耐药的主要基础，如： 乙胺丁醇耐药与embB基因突变有关，利福平耐药与rpoB基因突变有关。结核杆菌耐异烟肼的机制比较复杂，是通过katG基因突变导致菌体内过氧化氢酶-过氧化物酶活性降低或缺失，该基因是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因，这可以解释90%以上异烟肼的耐药。katG的完全缺失主要出现在高度耐异烟肼株。katG的随机突变最常见的位点是315位密码子，该位置的变异通过对katG活性位点甲基化阻碍了异烟肼与katG的结合，导致酶失去活化异烟肼的能力，inhA基因突变是异烟肼另一分子机制。而链霉素耐药与rpsL有关，多重耐药结核菌多由多种药物选择突变靶基因有关[13-14]。

2 应对多重耐药菌的对策

2.1 合理用药与耐药性监测 无论是质粒或染色体介导的耐药性，一般只发生在少数细菌内，只有当占优势的敏感菌因抗感染药物的选择性作用被大量消灭后，耐药菌才得以繁殖并导致感染，因此，细菌耐药性的发生和发展是抗感染药物广泛应用，特别是无指征滥用的结果[15]。合理用药可以治病； 反之，特别是抗菌药物滥用，将导致细菌耐药性产生与耐药菌感染流行，还会发生不良反应和药源性疾病。合理应用抗菌药物是预防延缓细菌耐药性产生的重要手段，而细菌耐药监测可为合理应用抗菌药物提供依据。在耐药监测中，细菌耐药性的产生与抗菌药物应用关系的研究，可谓重中之重。由于细菌耐药监测意义重大，全球各国都建立有自己相应的细菌耐药监测网络，这些细菌耐药监测网为促进各国抗菌药物合理使用发挥了积极作用[16]。

2.2 开发新药与快速药敏试验 耐药菌，特别是多重耐药和广泛耐药病原菌日趋严重的流行状况，极大地压缩了临床抗感染药物的选择空间，临床诊治难度加大，还增加了多重耐药菌传播、流行和产生新耐药变异的机会。开发高效抗菌新药是战胜多重耐药菌感染的最有效手段，已受到广泛关注和重视[17-18]。多重耐药菌对药物的抗性往往涉及多种耐药机制的协同作用，针对不同耐药机制靶标和全细胞代谢调控设计和开发抗菌新药，随着现代科学技术的发展、蛋白质组学和生物信息学的进步与融合，将带来新的机遇和挑战，并显示巨大发展潜力[19-21]。尽管抗菌新药在不断开发出来并投入应用，但病原菌耐药情势依然严峻，这表明合理用药才是不变的主题。

与新药开发同样紧急的任务是研制准确快速的药物敏感试验方法，只有尽快获得感染菌敏感药物谱，临床医生才有可能真正做到合理用药。病原菌分离培养、涂片镜检、菌种鉴定与耐药性检测是相互关联的环节，每一级环节上的结果都在不同层次上为临床医生提供了合理用药的有效依据。在微生物实验室，落实分级检验结果及时报告制度，为临床合理用药赢得了时间。采用分子生物学技术快速鉴定病原菌和检测耐药基因，已取得了长足的进步并得到初步应用。例如，通常获得结核菌药物敏感试验结果需要2个月或更长时间，而通过检测痰标本结核菌利福平耐药基因rpoB诊断MDR只需要4 d，而且灵敏度达91%，特异性达98%[22-24]。

另外，降钙素原(procalcitonin，PCT)监测浓度结果用于指导抗感染治疗，可明显缩短感染病人抗生素使用时间[25-27]；对传染性强、传播范围广的呼吸道感染病毒开展检测，将有利于防止滥用抗生素； 实现真菌药敏试验方法的标准化，将提升真菌耐药性检测质量[28]。以上诸项，就是目前应对临床多重耐药菌的主要措施。

1 吕吉云，曲芬．多重耐药微生物及防治对策［M］.北京：人民军医出版社，2011．

2 丛玉隆，尹一兵，陈瑜．检验医学高级教程［M］.北京：人民军医出版社，2010．

3 Mah TF， Pitts B， Pellock B， et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance［J］. Nature， 2003， 426（6964）：306-310.

4 曹志伟．抗生素耐药性机理及对策［J］.医药产业资讯，2005，2（23）：43-44．

5 Poirel L， Naas T， Nordmann P. Diversity， epidemiology， and genetics of class D beta-lactamases［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2010， 54（1）： 24-38.

6 Cattoir V， Nordmann P. Plasmid-mediated quinolone resistance in gram-negative bacterial species： an update［J］. Curr Med Chem，2009， 16（8）： 1028-1046.

7 Kumarasamy KK， Toleman MA， Walsh TR， et al. Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India， Pakistan， and the UK： a molecular， biological， and epidemiological study［J］.Lancet Infect Dis， 2010， 10（9）： 597-602.

8 Donlan RM， Costerton JW. Biofilms： survival mechanisms of clinically relevant microorganisms［J］. Clin Microbiol Rev， 2002，15（2）： 167-193.

9 O'Toole G， Kaplan HB， Kolter R. Biofilm formation as microbial development［J］. Annu Rev Microbiol， 2000， 54 ：49-79.

10 Yong D， Toleman MA， Giske CG， et al. Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene， bla（NDM-1）， and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2009， 53（12）：5046-5054.

11 Anderl JN， Franklin MJ， Stewart PS. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2000， 44（7）：1818-1824.

12 Ribera A， Ruiz J， Jiminez de Anta MT， et al. Effect of an efflux pump inhibitor on the MIC of nalidixic acid for Acinetobacter baumannii and Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates［J］. J Antimicrob Chemother， 2002， 49（4）： 697-698.

13 Ramaswamy S， Musser JM. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis： 1998 update［J］.Tuber Lung Dis， 1998， 79（1）：3-29.

14 Heym B， Alzari PM， Honoré N， et al. Missense mutations in the catalase-peroxidase gene， katG， are associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis［J］. Mol Microbiol，1995， 15（2）：235-245.

15 党景东， 陈明. 浅析细菌耐药机制及控制对策［J］. 中国医药导刊，2011，13（7）：1238-1239.

16 董翠珍， 翁国斌， 许亚红， 等. 2007-2009年医院感染病原菌分布特点及趋势分析［J］.中华医院感染学杂志，2011，21（1）：131-133.

17 Koul A， Arnoult E， Lounis N， et al. The challenge of new drug discovery for tuberculosis［J］. Nature， 2011， 469（7331）： 483-490.

18 Yount NY， Yeaman MR. Emerging themes and therapeutic prospects for anti-infective peptides［J］. Annu Rev Pharmacol Toxicol，2012， 52：337-360.

19 Sacks LV， Behrman RE. Developing new drugs for the treatment of drug-resistant tuberculosis： a regulatory perspective［J］.Tuberculosis（Edinb）， 2008， 88（Suppl 1）：S93-S100.

20 王增霞，周善学．新型氨基糖苷类抗生素合成的最新进展［J］.国外医药：抗生素分册，2007，28（4）：155-166．

21 Barluenga S， Simonsen KB， Littlefield ES， et al. Rational design of azepane-glycoside antibiotics targeting the bacterial ribosome［J］.Bioorg Med Chem Lett， 2004， 14（3）： 713-718.

22 Costeira J， Pina J. Multi-drug resistant tuberculosis and the red queen - diagnosis speed is crucial［J］. Rev Port Pneumol， 2007，13（6）：869-877.

23 Palomino JC， Martin A， Von Groll A， et al. Rapid culture-based methods for drug-resistance detection in Mycobacterium tuberculosis［J］. J Microbiol Methods， 2008， 75（2）：161-166.

24 O'Riordan P， Schwab U， Logan S， et al. Rapid molecular detection of rifampicin resistance facilitates early diagnosis and treatment of multi-drug resistant tuberculosis： case control study［J］. PLoS One， 2008， 3（9）：e3173.

25 龙威， 邓星奇， 谢娟，等. 血清降钙素原测定在慢性阻塞性肺疾病急性加重期治疗中的意义［J］.中华急诊医学杂志， 2008， 17（9）：974-977.

26 孙立峰．降钙素原监测在危重症患者细菌性感染中的临床应用［J］.中外医疗，2008，27（32）：141-141．

27 Nobre V， Harbarth S， Graf JD， et al. Use of procalcitonin to shorten antibiotic treatment duration in septic patients： a randomized trial［J］ .Am J Respir Crit Care Med， 2008， 177（5）： 498-505.

28 徐艳，钟白玉，于军校，等．150例酵母样真菌的菌种分布及其耐药性分析［J］.中国真菌学杂志，2009，4（4）：218-220．