氢氧化铝干粉与凝胶制作大鼠哮喘模型的效果比较

董 峰，唐红卫，吴小利，向代军，兰晓梅，徐 菡，王成彬

解放军总医院 临检科，北京 100853

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，伴有气道高反应性、可逆性气流受限，晚期还可出现气道重塑。目前，全球范围内哮喘发病率及病死率逐年上升，但至今对其发病机制仍不十分清楚。鉴于人体实验的局限性及体外模型与体内模型的巨大差异，科学家广泛借助于动物模型来研究哮喘。近年来，关于大鼠和小鼠过敏性哮喘模型的报道日益增多，一些文章[1-2]报道了利用氢氧化铝干粉制作大鼠过敏性哮喘模型进行哮喘研究，另一些文章[3-4]报道了利用氢氧化铝凝胶制作大鼠哮喘模型进行哮喘研究，但目前尚无关于氢氧化铝干粉与凝胶制作大鼠哮喘模型效果差异的报道。本文结合目前开展的研究工作，分别用佐剂氢氧化铝干粉、氢氧化铝凝胶制作大鼠哮喘模型，比较两种类型佐剂的造模效果。

材料和方法

1 实验动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠，体质量(250±20) g，由解放军总医院动物实验中心提供，合格证书号：SCXK(京)2006-0009。

2 试剂与仪器 卵清蛋白(Grade V，Sigma公司)；氢氧化铝干粉(Sigma公司)；灭活百日咳杆菌(天坛生物公司)；大鼠IFN-γ、IL-4检测试剂盒(达科为公司)；高效组织细胞裂解液(索莱宝公司)。显微镜(Olympus公司)；酶标仪(Awareness公司)；离心机(Thermofisher公司)。

3 实验动物分组 30只Wistar大鼠随机分为3组，每组10只。分别为A正常对照组，B氢氧化铝凝胶造模组，C氢氧化铝干粉造模组。动物饲养及实验操作均在标准清洁级动物实验室内完成，室温20~25℃，12 h光照/黑暗周期。动物自由饮水摄食。

4 模型制备 致敏参照文献[5]方法进行。B组：于第1天、第8天在每只大鼠皮下多点注射OVA悬液(含1 mg OVA和200 mg Al(OH)3凝胶)，同时腹腔注射灭活百日咳杆菌6×109个；第15天起气道内滴入0.75%的OVA 200μl，1次/d，连续4 d激发。C组：于第1天、第8天在每只大鼠皮下多点注射OVA悬液(含1 mg OVA和200 mg AL(OH)3干粉)，同时腹腔注射灭活百日咳杆菌6×109个；第15天起气道内滴入0.75%的OVA 200μl，1次/d，连续4 d激发。A组：以0.9%氯化钠溶液(normal saline，NS)为替代品进行上述操作。

5 大鼠行为学观察 激发后观察大鼠是否出现呼吸急促、喘息、口唇紫绀、扭体、躁动或行动迟缓等表现。

6 支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)采集及BALF中炎症细胞计数 最后1次激发结束24 h后，水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血致死后，迅速开胸行支气管肺泡灌洗；BALF 1 000 r/min离心10 min，弃上清，立即加入1 ml NS重悬细胞沉淀、充池、计数。另取0.1 ml细胞重悬液涂片，瑞氏染色，分类计数嗜酸细胞百分比。

7 肺组织病理学 灌洗结束后，分离大鼠右肺组织，置于4%多聚甲醛中固定，制作病理切片，用于HE染色和PAS染色。

8 肺组织匀浆细胞因子含量检测 取大鼠肺组织约100 mg，NS漂洗、除去血液、滤纸拭干后称重，加入组织块重量9倍的RIPA，制成10%的肺组织匀浆。将制备好的肺组织匀浆3 000 r/min离心15 min，取上清检测IFN-γ、IL-4的含量，具体操作依据试剂盒说明书进行。

9 统计学处理 实验结果以-x±s表示，以SPSS17.0统计软件处理。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠行为学观察 B组第1次激发后可见呼吸加深加快、点头运动、腹肌收缩等喘息症状，及抓挠口鼻、口唇紫绀、扭体表现；C组第3次激发后也可见上述表现；A组无上述症状。

2 BALF中细胞计数和嗜酸细胞百分比 B组、C组BALF细胞计数与A组相比显著增高(P＜0.05)；B组BALF细胞计数高于C组(P＜0.05)。同时，B组嗜酸细胞百分比高于A组和C组(P＜0.05)。见表1。

表1 灌洗液中细胞计数结果及嗜酸细胞百分比Tab.1 Cells and percentage of eosinophils in BALF

3 肺组织中细胞因子含量 与A组[(1 314.8±170.46)pg/ml]相比，B组[(929.1±172.07)pg/ml]和C 组 [(1 066±116.99)pg/ml]中 IFN-γ 含 量 显 著降低(P＜0.01)。A组与B组大鼠肺组织匀浆中IFN-γ含量无统计学差异。另外，所选试剂盒未能检测出大鼠10%肺组织匀浆标本中IL-4含量。

4 肺组织病理学 HE染色：C组与A组相比，见气道及血管周围炎症细胞浸润，嗜酸细胞有增多(图1，C与A)；B组与A组相比，见气道上皮损伤，结构紊乱，支气管及血管周围大量炎症细胞浸润，嗜酸细胞显著增多，并浸润各层(图1，B与A)。PAS染色：与A组相比， B组杯状细胞明显增生(图2，B与A)，C组可见杯状细胞增生(图2，C与A)。

讨 论

大鼠及小鼠是常用的哮喘模型动物，最常用的造模方法是使用OVA对动物进行致敏和激发，以复制哮喘气道炎症反应过程。通常在OVA致敏环节中使用佐剂以使免疫系统产生预期的反应类型。常用的佐剂有灭活的百日咳杆菌和氢氧化铝。百日咳杆菌中的脂低聚多糖推进以Th2为主导的应答反应；文献报道[6]用于疫苗的佐剂氢氧化铝为不溶性胶状沉淀，其作用原理是氢氧化铝凝胶通过静电与免疫原(OVA)结合，进而增加OVA的免疫原性。氢氧化铝佐剂与OVA同时给药，可促进Th2表型[7]。致敏结束后，通常会通过雾化、滴鼻或气道内滴入的途径给予一定剂量的OVA以诱发哮喘发作。在本实验哮喘模型的制作过程中，B组与C组均采用了相同的操作、相同的致敏原(OVA)及灭活百日咳杆菌佐剂，唯一的区别在于氢氧化铝干粉佐剂与氢氧化铝凝胶佐剂，因此我们推断：佐剂的不同导致了造模效果的差异。

哮喘模型成功与否可以根据实验鼠哮喘发作的症状作出初步判断。在本次试验中，第1次激发结束后观察到B组大鼠出现了不同程度的呼吸急促、喘息、口唇及耳紫绀等，C组大鼠在第3次激发结束后也观察到了上述症状。

过敏性哮喘的典型特征是气道炎症细胞浸润，尤其是嗜酸性粒细胞增多。在BALF炎症细胞计数及嗜酸细胞百分比这一指标中，B组与C组显著高于A组，并且B组计数结果显著高于C组，这一结果证明B组气道炎症细胞浸润更为严重。除气道炎症细胞浸润外，哮喘反复发作还可使气道壁结构发生变化，在HE染色病理切片中，可见B组支气管及血管周围密集各种炎症细胞，包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞，其中以嗜酸细胞大量浸润最为特异，另外还可见气道黏膜不规则增生，皱褶减少，上皮细胞有不同程度的坏死、脱落。在PAS染色的病理切片中，可见B组杯状细胞显著增生、黏液分泌增多。C组肺组织病理切片也可见上述表现，但C组病理改变明显轻于B组。过敏性哮喘中存在Th1/Th2平衡紊乱。与A组相比，B组与C组大鼠肺组织匀浆中Th1细胞因子IFN-γ显著降低，体现了哮喘病理状态下Th1功能降低的特征。

以上指标均证明大鼠哮喘模型制作成功，同时也体现了氢氧化铝干粉造模与凝胶造模的差异。作为同一物质的两种不同形态，氢氧化铝凝胶为胶体悬浊液，氢氧化铝干粉为白色粉末状物质，不溶于水。田代印等[8]在实验中发现氢氧化铝干粉与OVA不能很好混合，放置后出现明显分层，作者在实验中也发现了同样的问题。相关研究报道[9]佐剂与抗原混合的程度会对抗原的免疫原性产生一定影响。根据本实验结果，我们推断：在哮喘造模中，氢氧化铝凝胶增强OVA所致的过敏反应的效果优于氢氧化铝干粉。

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