脊髓Toll样受体4在慢性瘙痒中的作用研究＊

孔 敏，周 芳，党秀静，武静茹

（徐州医学院／江苏省麻醉学重点实验室，江苏 徐州 221002）

瘙痒是危害人类健康、影响人类生活质量最常见的临床病症之一。流行病学调查显示，普通人群瘙痒的发病率为8%～12%［1］，临床上瘙痒症状可见于许多疾病及一些药物的不良反应［2－4］，其虽不致死却给患者生存和生活带来诸多不便［5］。最近研究发现，Toll样受体（Toll－like receptor，TLR）家族参与瘙痒过程，比如TLR7介导了氯喹引起的急性瘙痒行为［6］，TLR2参与了溢脂性皮炎的发病过程［7］。TLR7与TLR家族中另一个成员TLR4在脊髓均有丰富的表达且分享诸多下游信号通路［8－9］，而后者在瘙痒过程中的作用，尤其是慢性瘙痒过程中的作用尚有待研究。因此，本研究拟探讨脊髓TLR4在噁唑酮引起的慢性瘙痒中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择雄性昆明小鼠152只，体质量18～20g，由徐州医学院实验动物中心提供。于24℃下和昼夜交替的环境中饲养，自由摄食、饮水。所有动物适应环境7d后进行实验。本研究获得徐州医学院动物实验伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 噁唑酮购自Sigma公司，用丙酮溶解至0.5%；表 没 食 子 儿 茶 素 没 食 子 酸 酯 （epigaloctechin－3－gallt，EGCG）购自上海源叶生物科技有限公司；TLR4和β－肌动蛋白（β－actin）一抗购自Abcom公司，对应二抗和Western blot显色试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。

1.3 模型制作 按照文献［10］的方法，实验前1d，瘙痒部位脱毛。在动物颈背部脱毛处一次性涂抹噁唑酮（10μL，0.5%，溶于丙酮），7d后（时间重新从零计数，因此，首次刺激当天记作－7d）开始激发，在第0、2、4、7、9、11天给予同等剂量噁唑酮进行激发，观察行为学和分子生物学改变。

1.4 行为学观察 所有实验动物在激发前均放入15cm×15 cm×15cm的透明玻璃盒子中适应1h，涂抹溶媒或噁唑酮后重新放入盒子观察其搔抓行为。动物从后爪抬起到接触颈背部皮肤，不管其在瘙痒部位搔抓多长时间均记为一次完整的搔抓动作，最后以30min内完成的搔抓次数来衡量搔抓行为。

1.5 分组及处理 研究噁唑酮制慢性瘙痒模型，将小鼠随机分为3组：对照组（C组）40只，只在颈背部脱毛，不做任何处理；丙酮溶媒组（A组）40只，颈背部脱毛处涂抹10μL丙酮；噁唑酮组（O组）40只，颈背部脱毛处涂抹10μL噁唑酮。每组再分为－7、0、4、9、11d5个亚组（n＝8），按模型制作方法涂抹相应试剂，并在观察激发后30min内的行为学改变之后立即处死小鼠取脊髓颈膨大检测TLR4。在确定噁唑酮致慢性瘙痒后9d小鼠脊髓TLR4表达水平接近高峰的基础上，为研究腹腔注射EGCG的作用，将小鼠随机分为丙酮溶媒组（A组）、丙酮溶媒＋EGCG组（A＋E组）、噁唑酮组（O组）和噁唑酮＋EGCG组（O＋E组），n＝8。各组在第9天激发后8h开始腹腔注射EGCG（40mg／kg）或生理盐水，每8小时1次，直到第11天激发前，共计6次，最后一次给药30min后激发，观察激发后30min内的行为学改变，之后立即处死小鼠取脊髓颈膨大检测TLR4。

1.6 Western blot检测 －7d组在首次刺激后30min、其余各组在激发30min后随机取6只小鼠，断头处死，快速取出脊髓组织，匀浆后，4℃下10 000×g离心30min，收集上清液，采用BCA（bicinchonininc acid）法测定蛋白浓度，蛋白样品于－80℃保存。蛋白样本按1∶4加入5×SDS－PAGE上样缓冲液，95℃变性5min，每孔加样30μg用10%SDS－PAGE电泳，转至硝酸纤维素膜上。加入1∶500稀释的抗TLR4或β－actin一抗4℃过夜，TBST缓冲液，10×（Tris Buffered Saline Tween－20，10×）洗膜后，加入1∶1 000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗（购自中国南京碧云天生物科技有限公司）室温孵育1h，NBT／BCIP试剂盒（购自中国南京碧云天生物科技有限公司）显色。扫描条带，采用Adobe Photoshop软件分析各组灰度值，并以激发前TLR4表达为整体进行标准化后反映TLR4的表达水平。

1.7 统计学处理 应用SPSS11.0软件进行统计学数据分析，计量资料以表示，组间比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

与首次激发前相比，激发后各时间点小鼠的脊髓TLR4表达逐渐增加（图1），且与搔抓行为呈正相关关系（r＝0.947）。3组小鼠在不同时间点30min内的搔抓次数见表1。

在EGCG腹腔注射实验中（图2～3），与噁唑酮组相比，O＋E组小鼠搔抓次数明显减少（P＜0.05）、脊髓TLR4表达明显降低（P＜0.05），但仍高于丙酮溶媒组和 A＋E组（P＜0.05）。丙酮溶媒组和A＋E组的搔抓次数及TLR4表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 首次刺激及激发后各时间点脊髓TLR4表达

图2 4组小鼠搔抓次数比较

图3 4组小鼠脊髓颈膨大TLR4表达水平比较

表1 3组小鼠不同时间点30min内搔抓次数比较（，次）

表1 3组小鼠不同时间点30min内搔抓次数比较（，次）

＊：P＜0.05，与噁唑酮组比较。

组别 n －7d 0d 4d 9d 11d对照组 40 2.03±0.27 2.13±0.35＊ 2.00±0.93＊ 2.00±0.76＊ 2.38±0.74＊丙酮溶媒组 40 2.21±0.37 2.22±0.31＊ 3.62±0.74＊ 6.75±1.98＊ 7.25±1.83＊噁唑酮组 40 2.13±0.26 26.37±5.32 76.25±15.11 139.25±15.53 173.00±13.84

3 讨 论

2009～2010年是脊髓水平瘙痒发病机制研究突飞猛进的2年，有研究发现，脊髓背角表达谷氨酸转运体－2（glutamine transporter type 2，VGLUT－2）的神经元参与组胺依赖性和非组胺 依 赖 性 瘙 痒 的 介 导［11－12］；GRP／GRPR（gastin－releasing peptide，GRP；gastin－releasing peptide reportor，GRPR）介导了从外周到脊髓的瘙痒信号的转导，并且认为GRPR可以作为瘙痒的脊髓标志物［13－14］，这些都提示，脊髓水平在瘙痒的发生过程中起着重要的作用。

最近研究发现，TLR7介导了氯喹引起的急性瘙痒［6］。TLR家族成员分享诸多下游信号通路，如MyD88作为TLR7和TLR4的共同下游分子参与了诸多病理、生理过程［8－9］。但TLR4是否也参与瘙痒过程尚有待研究。慢性瘙痒较急性瘙痒持续时间更长、危害更大，因此，研究慢性瘙痒的发病机制显得更为重要和现实。小鼠颈背部皮肤局部反复涂抹噁唑酮可以诱发慢性皮炎、引起搔抓行为，成功复制慢性瘙痒模型，在每次涂抹噁唑酮后能产生在1h内较为严重的搔抓行为，此后温和的搔抓可持续至少8h，并且模型较稳定［10，15］。因此，本研究采用上述模型，选取代表性时间点（－7d，激发后0、4、9、11 d），研究脊髓TLR4水平在慢性瘙痒过程中的表达变化。结果发现动物搔抓行为与脊髓TLR4表达呈正相关关系，相关系数r＝0.947。TLR7通过进一步激活下游信号通路参与急性瘙痒过程，但是在噁唑酮引起的瘙痒过程中TLR4是否也同样是通过这些下游通路发挥作用尚需进一步的研究证实。

EGCG是绿茶中的一种黄酮类物质，作为TLR4的抑制剂已经成熟应用于TLR4相关的病理、生理过程的研究［16］。离体和体实验均证实，EGCG可能是通过抑制TLR4激活，进而抑制TLR4下游信号的传递发挥药理作用［17］。为进一步验证脊髓TLR4参与了噁唑酮引起的慢性瘙痒过程，本研究从噁唑酮激发后第9天开始每8小时腹腔注射EGCG 1次，每次剂量（40mg／kg），直到第11天激发前，共计6次。结果发现，多次注射EGCG可以部分抑制而不能完全抑制噁唑酮引起的搔抓行为，说明还有其他机制参与噁唑酮引起的慢性瘙痒过程。

综上所述，本研究成功复制了局部皮肤涂抹噁唑酮致慢性瘙痒模型，且发现脊髓TLR4表达水平与瘙痒行为相关，腹腔注射EGCG能抑制瘙痒行为和脊髓TLR4表达。脊髓TLR4参与了噁唑酮引起的慢性瘙痒过程，丰富了慢性瘙痒的发生机制，将为慢性瘙痒的治疗带来新的启示。

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