BMP2基因重组慢病毒载体质粒的构建及鉴定＊

林昭伟，李 奇，林荔军，刘云龙，帅 明，谢小波

（南方医科大学珠江医院骨科中心，广州 510282）

骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）是促进骨化的主要因子，可在骨损伤局部及异位促进细胞增殖，提高其碱性磷酸酶活性，也是惟一能够单独在异位诱导骨化形成的信号分子，这使其在骨关节疾病特别是骨折、骨缺损的临床治疗中具有极大的潜在应用价值［1－5］。将BMP2复合载体材料在特定部位释放，存在体内半衰期短，容易被体液冲走或稀释等缺点，很难保持局部有效治疗浓度。慢病毒载体对非分裂细胞能进行高效的转导，携带目的基因整合到靶细胞基因组，使之能长期、稳定和安全地在全身或局部表达，成为目前较理想的基因转移载体［6－8］。为此，本研究尝试构建重组慢病毒载体质粒pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2／T2A／EGFP，为骨缺损的基因治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 慢病毒载体质粒pLV.Des2d.P／neo，pDONR221，模板DNA，大肠杆菌Stbl3购自Cyagen公司，Gateway®BP ClonaseTMⅡEnzyme Mix，Gateway®LR ClonaseTMⅡPlus Enzyme Mix购自Invitrogen公司，QIAquick Gel Extraction Kit购自Qiagen公司，质粒小提试剂盒购自Tiangen公司，Taq DNA Polymerase，dNTP Mix，GeneRuler？1kb DNA Ladder购自Fermentas公司，PrimeSTARTMHS DNA Polymerase购自Takara公司，XmaⅠ和EcoRⅤ限制性内切酶购自Neb公司。其他试剂均为进口或国产。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增 attB1－Kozak－BMP2－T2A－EGFP－attB2。

1.2.1.1 引物设计与合成 根据Genbank的BMP2基因编码区（CDS）和 Gateway技术设计相应引物。attB1－Kozak－BMP2－F基因引物：5′－GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTG CCA CCA TGG TGG CCG GGA CCC GC－3′。BMP2－T2A－R－1基因引物：5′－AAG ACT TCC CCT GCC CTC TCC GGA GCC GCG CAC CCA CAA CCC TCC－3′。T2A－R－2基因引物：5′－GGC CGG GAT TTT CCT CCA CGT CCC CGC ATG TTA GAA GAC TTC CCC TGC CCT CT－3′。T2A－EGFP－F基 因 引 物：5′－CGT GGA GGA AAA TCC CGG CCC CAT GGT GAG CAA GGG CGA GG－3′。attB2－EGFP－R基因引物：5′－GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTT TAC TTG TAC AGC TCG TCC ATG－3′。引物由广州赛业生物公司合成。PCR融合过程示意图（图1）。

1.2.1.2 PCR反应体系及扩增程序 取一高压灭菌0.2mL EP管，并建立以下反应体系：5×Primer STARTMBuffer（Mg2＋Plus）：10μL；dNTP Mixture（2.5μmol）：4μL；引物－F（10μmol）：1μL；引物－R（10μmol）：1μL；模板 DNA：1μL；Primer STARTMHS DNA Polymerase：0.5μL；补加双氧水至总体积50μL。98℃预变性3min，98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸1.5 min共30个循环，72℃延伸5min，6×loading Buffer终止反应，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，DNA琼脂糖凝胶电泳回收参照QIA－quick的琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收，－20℃冰箱保存。

1.2.2 利用 Gateway Technology构建 pDown－BMP2－T2AEGFP 在25℃的条件下BP反应1h，反应体系：attB1－KBMP2－T2A－EGFP－attB 2∶100ng；pDONR 221∶100ng；BP clonase：1μL；TE buffer：up to 5μL。加入0.5μL蛋白酶 K于37℃终止反应10min，转化BP反应产物到大肠杆菌Stbl3，把100μL转化物涂到含有50μg／mL Kan的LB平板上37℃孵育过夜。XmaⅠ和EcoRⅤ双酶切鉴定筛选阳性克隆，挑取阳性克隆质粒，并将阳性克隆的质粒送赛业生物公司测序，测序引物：pUpDo－flank－F：CGG CCA GTC TTA AGC TCG GG；pUpDo－flank－R：AAT ACG ACTC ACT ATA GGG GA；W1F：ACA CCA GGT TGG TGA ATC AG。

1.2.3 利用 Gateway Technology构建 pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2／T2A／EGFP 在25℃条件下LR反应16h，反应 体 系：pDown－BMP2－T2A－EGFP：15.02ng；pUp－EF1A：12.89ng；母载体pLV.Des2d.P／neo：60.28ng；LR clonase：1 μL；TE buffer：up to 5μL。加入0.5μL蛋白酶K于37℃终止反应10min。转化LR反应产物到大肠杆菌Stbl3，菌落PCR筛选阳性克隆，反应体系：10×Taq Buffer with（NH4）2SO4：3μL；dNTP Mixture（2μmol）：3μL；MgCl2：2μL；引物－F（10μmol）：1.2μL；引物－R（10μmol）：1.2μL；Taq DNA polymerase：1.5μL；模板DNA：2μL；灭菌水：16.1μL；总体积30 μL。94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min共29个循环，72℃延伸5min。挑取阳性克隆质粒，阳性克隆送交赛业生物公司测序，测序引物：pLV－Final－internal－F：CAA GTT TGT ACA AAA AAG CAG GCT；pLVFinal－internal－R：AGC CTG CTT TTT TGT ACA AAC TTG。

图1 PCR融合过程示意图

2 结 果

2.1 pDown－BMP2－T2A－EGFP的构建（图2） 随机挑取2个克隆，pDown－BMP2－T2A－EGFP用限制性内切酶 XmaⅠ和EcoRⅤ双酶切后，酶切条带理论大小为1 100bp，与目的条带大小相符的克隆即为阳性克隆，测序结果同GenBank中报道序列一致，波谱未列出。

图2 pDown－BMP2－T2A－EGFP酶切鉴定

2.2 pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2－T2A－EGFP重组质粒构建（图3） 随机挑取6个克隆，菌落PCR鉴定条带理论大小为2 000bp，与目的条带大小相符的克隆即为阳性克隆，测序结果同GenBank中报道序列一致，波谱未列出。载体结构图谱见图4。

图3 pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2－T2A－EGFP PCR鉴定

图4 pLV.EX2d－EF1A＞BMP－2／T2A／EGFP载体结构图谱

3 讨 论

生物活性因子在促进骨缺损修复过程中发挥极其重要的作用，而促进新骨形成的活性因子显得尤为重要。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是参与骨形成的重要活性物质，其中BMP2是BMP家族成员中作用最强的因子。BMP2直接或通过载体局部应用可促进骨形成［1－2］。但BMP2属于小分子物质，如果单纯将其于局部注射，势必被组织液稀释或血液带走，同时BMP2半衰期较短，在注入体内后，轻易地被体内蛋白水解酶水解失去活性，难以发挥有效的骨诱导作用。而近年来发展的缓释技术则存在操作复杂、包封率低、价格昂贵，且有效安全的局部剂量很难达到，生物活性不能得到最大利用，难以全面满足组织工程骨体内修复这一复杂过程的需要。因此，寻找一种有效的BMP2局部稳定、缓慢释放方法就显得极为重要。

基因治疗可使生物活性因子在局部稳定地释放，在骨缺损修复领域中显示出良好的运用前景。许多研究证实，基因治疗可有效促进骨再生［9－12］。目前，基因治疗的载体主要分为病毒载体和非病毒载体。由于病毒基因组结构简单，易于改造和操作，且感染效率高，有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的。慢病毒载体是一类逆转录病毒载体，它既能够感染分裂细胞，也能够感染非分裂细胞，由于慢病毒载体能够感染大多数非分裂细胞，以及具有高效地整合和稳定地表达目的基因于靶细胞的能力，所以，已被广泛应用于各种基因治疗实验研究［13－15］。Gateway技术是基于λ噬菌体位点专一重组系统的一种通用的克隆技术，能够快速地、高特异性地将异源DNA片断克隆到不同的载体中。这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为入门克隆。本研究显示，直接调取BMP2基因，能与数据库序列保持高度一致，减少变异，利用 BP 反 应 构 建 入 门 克 隆 pDown－BMP2－T2A－EGFP，以pLV.Des2d.P／neo为目的载体利用LR反应构建pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2／T2A／EGFP。

经过测序证明，本研究成功构建了携带BMP2基因的慢病毒载体质粒，同时加入了与之共表达的报告基因EGFP和NEO抗性基因，有利于感染后细胞的观察和筛选，为下一步进行病毒包装及转染奠定基础。

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