ELISA方法在检测猪血清中PRRSV抗体中的应用

蒋成砚，杨秋艳，鲁 念，王 琴，唐 悦，郑 娥

（红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自 661100）

猪繁殖呼吸综合症病（PRRS）是给养猪业造成重要危害的传染病之一，能感染不同年龄阶段、不同品种以及不同性别的猪群，据报道，PRRS在国内大部分养猪地区都有流行，感染率达到58%以上[1]。目前对该病没有很好的防治措施，只有进行实时监控，准确把握猪群的感染情况，通过严格的生物安全制度逐渐进化该病，因此血清学检测是制定和实施PRRS防制措施的关键环节。本研究小组采用ELISA方法对不同饲养模式的不同年龄阶段的猪群进行抗体检测，以便了解猪群PRRSV感染情况。

1 材料与方法

1.1 材料

随机无菌采集红河州部分规模化猪场以及散养户不同年龄和性别的猪血清1 052份，记录并编号，置-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2 试剂盒 购于云科生物科技有限公司，上海卡努生物有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1 样品收集、处理及保存方法

血清：使用不含热原和内毒素的试管，收集血液后，3 000r/min离心10 min将血清和红细胞迅速小心地分离；收集血清-20 ℃保存。

1.3.2 试剂的准备

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

1.3.3 洗板方法

手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1 min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

1.3.4 操作步骤

（1）从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4 ℃。

（2）设置标准品孔、样本孔和空白孔，空白孔什么都不加，标准品孔各加不同浓度的标准品50 uL。

（3）待测样本孔先加样本稀释液40 μL，在加待测样本 10 μL。

（4）随后标准品孔和样本孔中（空白孔不加）加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min。

（5）弃去液体，吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

（6）所有孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。

（7）所有孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.3.5 结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

2 结果

2.1 1 052份猪血清PRRSV抗体检测结果

把采集的血清样品通过ELISA检测发现，1 052份血清样品中有599份为PRRS抗体阳性，平均阳性率为56.9%。从阳性血清分布的地域看，各地平均阳性率差异较大（表1）。

表 1 1052份猪血清PRRSV抗体检测结果

2.2 不同品种猪血清中PRRSV抗体的阳性率比较

把采集的1 052份血清样品按不同品种来分，三元杂、五元配套系杜洛克、本地猪以及长白猪血清样品PRRSV抗体的阳性率有明显差别（表2）。

2.3 不同年龄段猪血清中PRRSV抗体阳性率比较

表 3 不同年龄段猪血清中PRRSV抗体的阳性率比较

2.4 不同饲养条件猪血清中PRRSV抗体的阳性率比较

对规模化饲养场和农户散养的模式比较发现，两种不同的饲养模PRRSV抗体的阳性率有明显的差别（表4）。

表 4 不同饲养模式猪血清中PRRSV抗体的阳性率比较

3 讨论

ELISA方法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，因此，也适合于血清流行病学调查。例如，魏明奎[2]等根据ELISA方法对信阳市10县区86个规模养殖场未进行PRRSV免疫接种的1 329份血清进行PRRSV抗体检测结果显示，在信阳PRRS感染还相当普遍。本课题组通过ELISA方法，基本掌握该地区猪群PRRSV的感染情况：平均阳性率为56.9%，不同年龄阶段的猪有不同程度感染，散养猪的感染率比规模化养殖高，断奶仔猪的感染率比其它年龄阶段的猪感染率高，瘦肉型猪抗感染能力弱。

PRRS属于免疫缺陷病，PRRSV感染后破坏猪只的免疫系统，导致继发感染其它疾病，加快猪只的死亡。另外，PRRSV高度可变，注射疫苗保护效率不佳，甚至会引起毒株变异为强毒。对于该病临床上治疗效果不佳，只有采取有效的防制措施，科学管理，改进现有农村养猪模式，引导农民通过集资、入股等形式兴办现代化规模养殖场，进行统一管理。执行严格的生物安全制度，才能更好地防制该病的发生。

[1]Xini N G，Cheng A C，Wang M S. Advance in researches on porcine reproductive and respiratory syndromevirus[J]. Swine Production，2004（4）：36-38.

[2]魏明奎，薛邦玉，郭小参，等. 用ELISA方法检测猪血清中PRRSV抗体[J].畜牧与兽医，2010，42（9）：77-78.