禽源大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定与耐药性检测

李淑芳，曹 慧，黄燕霞，陈冬杰，邹海鹏，迟明飞，陈伟垣，谢文斌

（广东海洋大学动物医学系，广东湛江 524088）

食源性微生物的危害一直是食品安全关注的焦点，在过去几十年中，很多国家报告的食源性疾病的主要病原性微生物一直是沙门氏菌属和弧菌属细菌，其中，日、美等发达国家发生的食物中毒事件中40%～80%是由禽沙门氏菌引起[1]。近些年，在食物链中又出现了新的严重危害，如肠出血性大肠杆菌（EHEC）[2]。 在我国，大肠杆菌和沙门氏菌同样是对人类和动物健康构成极大危害的主要食源性致病菌，食用动物是其主要宿主，特别是鲜肉、蛋和奶等畜禽产品中肠出血性大肠杆菌O157：H7和沙门氏菌污染对食品安全构成了严重威胁，严重危害着人类和动物的健康[3-6]。为了解湛江市市售禽肉产品中致病性大肠杆菌和沙门氏菌的污染状况及耐药情况，2012年5月至11月，在湛江市1个大型农贸市场和1个大型超市采集市售禽肉中的肝脏样品。同时，选择1个小型养殖场，随机采集活鸡的泄殖腔棉试子样品，进行了大肠杆菌、EHEC O157：H7和沙门氏菌的分离鉴定与部分分离菌株的药敏试验，为进一步加强动物源性食品安全管理和有效防控人畜共患病的传播和流行奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

选择湛江市霞山区1个大型农贸市场和1个大型超市，采集市售禽肉中的肝脏样品共61份，其中鸡肝脏40份，鸭肝脏21份。采集后每份样品独立分装于食品保鲜袋中，放入冰壶送实验室检验。另选择1个小型养殖场，随机选择20只产蛋鸡，无菌采集泄殖腔棉试子，放于盛有1 mL灭菌生理盐水的无菌试管中，送实验室检验。

1.2 培养基及试剂

麦康凯培养基、DHL培养基、M-H琼脂、营养琼脂、营养肉汤、葡萄糖发酵管、E40/12肠杆菌科细菌生化鉴定系统、S019大肠埃希菌O157：H7/NM生化鉴定套装，均购自北京陆桥技术有限责任公司；药敏纸片、革兰氏染液，购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大肠杆菌分离培养与鉴定

1.3.1.1 大肠杆菌分离培养及形态观察 用灭菌生理盐水将采集的肝脏样品冲洗2～3遍去掉血污后，用灭菌手术剪剪下一小块肝脏，将肝脏新鲜断面在麦康凯琼脂培养基的一端涂抹2次，泄殖腔棉试子样品直接涂抹于麦康凯培养基，然后用接种环从样品触面分区划线进行细菌分离培养。每个样品接种1个麦康凯琼脂平板，37 ℃培养18～24 h，每个平板挑取3～5个单个红色菌落，接种于普通琼脂培养基用于生化试验和保存菌种。同时，进行涂片、革兰染色和镜检。

1.3.1.2 大肠杆菌生化试验 将在麦康凯培养基上生长为红色菌落、革兰染色阴性、镜检疑似大肠杆菌的菌株，接种营养琼脂，37 ℃培养18～24 h，刮取3～5个新鲜菌落，用灭菌生理盐水配制成浓度为0.5麦氏比浊单位的菌悬液。根据E40/12肠杆菌科细菌生化反应鉴定系统说明，首先进行葡萄糖发酵试验，糖发酵试验阳性菌株继续进行16种生化反应试验。与大肠杆菌符合率为100%的菌株判为大肠杆菌。

1.3.2 肠出血性大肠杆菌O157：H7生化试验鉴定选择E40/12肠杆菌科细菌生化反应鉴定后的大肠杆菌，接种营养琼脂培养基，37 ℃培养18～24 h，刮取新鲜菌落配制成细菌浓度为0.5麦氏比浊单位的菌悬液，根据S019大肠埃希菌O157：H7/NM生化鉴定套装试剂盒说明，进行10项生化反应试验，结果完全符合目标菌生化反应现象者判为O157：H7阳性菌株（判定标准见表1）。

表 1 大肠杆菌O157：H7/NM生化反应鉴定结果判定标准

1.3.3 沙门氏菌分离培养与鉴定

将采集的试验样品按照1.3.1.1的方法进行预处理后，接种于DHL琼脂平板上，37 ℃培养18～24 h，菌落中心呈黑色、周边为无色半透明的单个菌落判为疑似沙门氏菌菌落。用接种环蘸取沙门氏菌疑似菌落，划线接种于营养琼脂培养基进行纯化培养，取新鲜培养物配制成细菌浓度为0.5麦氏比浊单位的菌悬液，进行葡萄糖发酵试验。葡萄糖发酵试验阳性菌株继续进行E40/12肠杆菌科细菌生化反应鉴定系统规定的16种生化试验。生化试验结果与沙门氏菌符合率为100%的确定为沙门氏菌。

1.3.4 药敏试验 采用世界卫生组织推荐的纸片琼脂扩散法，选择上述分离菌株中的21株大肠杆菌和11株沙门氏菌针对26种常用抗菌药物进行药敏试验。将被检菌株接种于营养琼脂培养基，37 ℃培养18～24 h，刮取新鲜菌落或菌苔，制备浓度为0.5麦氏比浊单位的菌悬液，均匀涂布于营养琼脂平板，然后将药敏片贴附于M-H琼脂平板上，37 ℃培养18～24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。每株细菌设2个重复，取均值。药敏结果判定标准参照文献[7]。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定结果

经分离培养、形态学检查和生化试验鉴定，从81份市售禽肉中肝脏样品和养殖家禽泄殖腔棉试子样品中共分离出大肠杆菌35株，检出率为43.21%。其中检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7 7株，检出率为8.64%；检出沙门氏菌11株，检出率为13.58%。分离菌株在试验样品中分布情况见表2。20份养殖场活鸡泄殖腔棉试子样品检共出肠出血性大肠杆菌O157∶H7 6株，总检出率为30%，占检出大肠杆菌总数的42.86%；检出沙门氏菌检2株，检出率为10%。表明该养鸡场肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染比较严重。40份农贸市场和超市出售的鸡肉中肝脏样品没有大肠杆菌O157∶H7，检出沙门氏菌检3株，检出率为7.5%；21份市售鸭肉中肝脏样品检出1株肠出血性大肠杆菌O157∶H7，检出率为4.76%；检出沙门氏菌6株，检出率为28.57%。表明湛江市市售禽肉产品存在肠出血性大肠杆菌O157∶H7污染，且沙门氏菌比较严重，应加强农贸市场和超市禽肉产品的卫生检验与监督管理工作。

表 2 大肠杆菌和沙门氏菌分离试验结果

2.2 药敏试验结果

21株大肠杆菌和11株沙门氏菌对26种常用抗生素药敏纸片的药敏试验结果见表3、4和5。试验结果显示，多数被检菌株对多种药物呈现不同程度的耐药性，多重耐药（MDR）现象普遍（表3、4）。21株被检大肠杆菌中仅有1株对26种抗生素均无耐药，有14株大肠杆菌呈现三重以上耐药，占被检大肠杆菌总数的66.7%；其中1株大肠杆菌对14种抗菌药物耐药，2株大肠杆菌对6种抗菌药物耐药。11株沙门氏菌均有耐药现象产生，6株呈现三重以上耐药，占被检沙门氏菌的54.55%。其中2株沙门氏菌对8种抗菌药呈现耐药，仅有3株沙门氏菌对1种抗生素呈现耐药。

表 3 21株大肠杆菌耐药种类分布

表 4 11株沙门氏菌耐药种类分布

同一药物对不同菌株的作用效果存在较大差异（表5）。试验结果显示，大肠杆菌产生耐药率最高的药物是四环素、苯唑西林和头孢西丁。21株被检大肠杆菌中有18株对上述3种药物呈现耐药，耐药率均为85.71%。其次被检大肠杆菌是对氨苄西林和氯霉素的耐药率较高，耐药率分别为47.62%和38.10%。沙门氏菌产生耐药率最高的药物是苯唑西林，被检11株沙门氏菌中有10株对苯唑西林耐药，耐药率达90.91%，其次是对氨苄西林的耐药率54.55%，对四环素的耐药率为36.36%。被检大肠杆菌均没有产生抗药性的药物是庆大霉素、氧氟沙星、阿米卡星、头孢吡肟、呋喃妥因。被检沙门氏菌均没有产生抗药性的药物是氧氟沙星、阿米卡星、环丙沙星、诺氟沙星、左氟沙星、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻吩、头孢西丁、头孢曲松、氨曲南。结果表明被检大肠杆菌和沙门氏菌对喹诺酮类和头孢类抗生素的耐药菌株相对较少。

表 5 大肠杆菌和沙门氏菌药敏试验结果

3 讨论

3.1 禽源肠出血性大肠杆菌O157：H7和沙门氏菌分离结果与安全风险分析

肠出血性大肠杆菌O157：H7感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，目前已成为在世界范围内对人类构成重大威胁的新传染病之一[8-9]。1982年，首次在美国暴发大肠杆菌O157：H7引起的出血性肠炎，之后便在多个国家爆发，1987年以来，在我国一些省市先后发现了肠出血性大肠杆菌感染的患者。肠出血性大肠杆菌O157：H7通过消化道进入大肠，穿过黏液层侵入肠上皮细胞，在上皮细胞胞浆中增殖并分泌志贺样毒素（Shigalike toxin，SLT），SLT分子通过与敏感细胞表面的Gb3受体结合而发挥毒性。Gb3受体广泛地存在于机体肠上皮细胞、血管内皮细胞、肾和神经组织细胞等，当SLT损害结肠上皮细胞产生出血性结肠炎（HC），损害血管内皮细胞、红细胞、血小板导致溶血。肾小球微血管内皮细胞能产生大量的Gb3，因此SLT引起广泛肾小管坏死，约5%～10%的肠出血性大肠杆菌O157：H7感染者出现以急性肾功能衰竭、溶血性贫血和血小板减少为特点的溶血尿毒综合症（HUS），而出现急性肾功能衰竭和溶血尿毒综合症（HUS）的病死率为3%至5%，最高可达50%[9]。由于SLT毒素的作用，副交感神经兴奋性增强，出现窦性心动过缓以及惊厥，SLT还能刺激内皮细胞释放Ⅷ因子从而形成血栓性血小板减少性紫癜（TTP），血栓形成性血小板减少性紫癜多发生于20～30岁的青年人，病情发展迅速，90天内有70%的病人死亡，复发率为37%[9]。牛、羊、猪和鸡等畜禽是大肠杆菌O157：H7的天然宿主，因此，鲜肉、蛋、乳等动物源性食品的污染成为重要的污染源。在本次试验中，20份养殖场活鸡泄殖腔试子样品经分离培养和生化试验分离到6株疑似大肠杆菌O157：H7，检出率为30%，表明该养殖场存在较严重的大肠杆菌O157：H7污染。61份市售禽肉产品中检出1株疑似肠出血性大肠杆菌O157：H7，检出率为1.64%。说明湛江市市售禽肉产品存在大肠杆菌O157：H7污染的风险。

目前，已知沙门氏菌有2499个血清型广泛分布于自然界中，鸡、鸭、鹅、猪、牛、马、羊以及各种鱼类、鼠类均可带菌[3-4]。本次试验中，20份养鸡场活鸡泄殖腔试子样品分离到2株沙门氏菌，检出率为10%。从61份市售禽肉产品中检出9株沙门氏菌，检出率为14.75%，高于2001年中国疾病预防控制中心在全国11个省生肉产品中沙门氏菌平均检出率9.35%。

本次试验的采样范围和样本数量较小，虽然不能准确代表湛江地区的大肠杆菌和沙门氏菌对市场销售禽肉产品的真实污染状况，但试验结果提示，湛江市养殖家禽和市售禽肉产品中的确存在重要食源性致病菌大肠杆菌O157：H7和沙门氏菌的污染，应当引起当地居民和食品安全相关部门的高度重视。湛江市地处粤西地区，当地居民喜食各种禽肉食品，如隔水蒸鸡、白切鸡、盐焗鸡等地方特色的禽肉产品深受广大居民青睐，由于某些禽肉产品的加工以半熟状态为特色，骨中带血，某些病原微生物及其毒素不能完全被杀死，增加了微生物及其毒素引起食源性疾病的风险。同时，为了保证禽肉的新鲜，几乎每个大型农贸市场和大型超市都设有家禽屠宰点，使得该地区活禽及禽肉产品的交易和流通比较繁荣，活禽及其肉类产品主要流通于广东和广西的部分地市，给病原微生物的扩散和传播带来有利条件，对流通地区的家禽养殖业和群众健康安全带来较大的威胁。因此，做好市场动物源性食品主要病原微生物的监测和流行病学调查工作，贯彻和落实家禽定点屠宰、集中检疫制度，保障动物性食品的食用安全和养殖业的生物安全势在必行。

3.2 大肠杆菌与沙门氏菌的耐药性分析

由于抗生素在医学和兽医学上广泛使用，近20年来，食源性致病菌大肠杆菌和沙门氏菌的耐药性急剧增强，严重的是多重耐药菌株的出现，会从食用动物传播给人[10]。在本次试验中，被检大肠杆菌和沙门氏菌的多数菌株同样呈现多重耐药现象，66.7%的大肠杆菌呈三重以上耐药，最多对18种药物耐药；54.5%的沙门氏菌呈三重以上耐药，最多对10种药物耐药。从耐药谱看，每个被检菌株对所选药物几乎都有各自一定的耐药谱，和以往耐药性研究试验结果比较，2012年，在湛江地区，从市售禽肉产品和养殖场家禽中分离的大肠杆菌和沙门氏菌的耐药谱和耐药率与以往报道广东地区的数据比较[11-12]，均有较大变化。被检大肠杆菌对四环素、苯唑西林和头孢西丁的耐药率为85.71%，远远高于常维山等[11]报道2007—2008年广东省大肠杆菌对四环素的耐药率为的29%，也高于2009年朱乾坤等[12]对广东省10多个地市禽源大肠杆菌对四环素的耐药率78.75%。该试验结果说明在该地区兽医临床不规范使用四环素的情况可能比较严重。可喜的是本试验被检大肠杆菌对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、环丙沙星、氧氟沙星的耐药率均低于文献[9-10]报道结果。细菌对抗菌药物的耐药谱和耐药率与该地区抗生素使用情况密切相关，头孢类抗生素和喹诺酮类抗菌药物是目前临床上治疗细菌病的常用药物。本次试验被检大肠杆菌和沙门氏菌对青霉素类抗生素呈现普遍耐药，除头孢西丁外，被检菌株对头孢类抗生素和喹诺酮类抗菌药物的敏感性好、耐药率低，所有被检菌株均没有产生耐药性的有头孢吡肟、氧氟沙星、阿米卡星。这一结果一方面说明本地区抗菌药物规范使用情况可能较好，另一方面也是可能由于被检样品动物多数来源于农村散养户，抗菌药物使用较少所致。总之，做好禽源致病菌的流行病学调查、耐药性和耐药谱监测工作，有利于动物源性人畜共患病的实时监测、提前预警，为有效防治人畜黄患病工作提供可靠依据。

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