MicroRNA-29 a对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

张凤香 关 宁 李晨光 孙大鹏 罗俊生

(辽宁医学院附属第一医院心外科，辽宁 锦州 121001)

血管平滑肌细胞(VSMC)位于血管中膜，是血管中层惟一的细胞成分，VSMC既可以调节血管张力，又可以维持血管功能。研究表明VSMC的增殖、迁移是高血压、动脉粥样硬化血管重塑等内膜增厚性疾病的重要病理生理因素。microRNA和一般的RNA一样都是由基因编码的。microRNAs的基因广泛存在于各个染色体中，这些microRNAs虽然只占人类基因总数的2%，却调控着人类30%以上的基因表达。研究发现多个MicroRNA在血管平滑肌细胞中特异表达，并可以对血管平滑肌细胞的增殖和迁移进行调节，从而影响动脉粥样硬化斑块的形成。MicroRNA-29 a不但参与肿瘤形成、免疫炎症反应、细胞因子分泌、葡萄糖代谢等过程，还可以在VSMC大量表达。因此，本实验就MicroRNA-29a对VSMCs增殖和迁移的影响进行研究，以探讨其治疗心脑血管性疾病的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，100～180 g(武汉大学实验中心);DMEM、胎牛血清(Hyclone公司);胰蛋白酶、CCK8试剂盒(GIBCO公司);MicroRNA-29 a反义寡核苷酸(上海生工);兔抗鼠PCNA抗体、兔抗鼠 MMP-9、MMP-2抗体、小鼠抗β-actin单克隆抗体、PCR试剂盒、HRP标记山羊抗小鼠二抗(北京中杉金桥公司)。

1.2 细胞培养及转染 选取100～180 g雄性 SD大鼠，取胸腹主动脉血管中膜，用贴块法分离、培养 VSMC。细胞在含10%FBS的DMEM中生长至汇合后，0.25%胰蛋白酶消化传代，取3～6代细胞进行实验。MicroRNA-29 a反义寡核苷酸转染按照lipofectamine2000说明书操作，将VSMC分为3组:空白对照组(加入同等量的lipofectamine2000);MicroRNA-29 a反义寡核苷酸(50 nmol/L)组:MicroRNA-29a错义链(50 nmol/L)组，5 h后换完全培养基，显微镜下观察转染效率。

1.3 MTT法检测VSMCs活力 将处于对数生长期的 VSMC接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，贴壁后转染，分别于转染后24 h、48 h、72 h用MTT法检测细胞增殖状态。每组每孔取200μl加入96孔板板中，每孔加入20μl 5 mg/ml的MTT液，37℃5%CO2继续培养4 h，去上清，每孔加入100μl DMSO充分溶解。用酶标仪测定各孔吸光度值，波长570 nm。

1.4 划痕法检测VSMCs迁移 取对数生长期VSMCs接种于培养皿，调整细胞浓度以致第2天覆盖达到约90%，按上述分组进行转染。在培养皿底部做一直线标记，用无菌枪头在无菌条件下沿标记线作划痕，PBS液漂洗后加入含1%FBS的DMEM，孵育12 h后重新加入含10%FBS的 DMEM，37℃、5%CO2培养。分别在0、24、48、72 h于各组镜下随机选取10个视野进行拍摄，测量两边细胞迁移边缘之间的距离即划痕宽度，然后取均值。

1.5 Western印迹检测MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白的表达转染48 h后常规提取总蛋白，每孔加入20μl蛋白溶液，电泳分离后转膜，体积分数5%牛奶封闭2 h，加入一抗，4℃孵育过夜。TBST清洗后，加入二抗孵育1 h，TBST清洗。加入ECL发光液100μl，在ImageQuant RT ECL冷 CCD成像系统进行显影，用Imagequant TL软件进行半定量分析。

1.6 RT-PCR检测相关mRNA的表达 转染48 h后收集并计数各组细胞，用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，经紫外分光光度计检测RNA浓度，参照反转录试剂盒说明书进行发转录反应。反转录PCR法检测;PCNA:正义链5'-ACCACCATCACCACCATCATC-3'，反 义 链'-TGGAAGAGTTGGAGCACAGG-3';MMP-9:正义链 5'-GAACATCATCCCTGCCTCCAC-3'，反义链'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3';MMP-2:正 义 链 5'-GUAAUCGAGAGGCUGAGUA-3'，反 义 链 5'-UACUCAGCCUCUCGAUUAC-3';MicR-29a:正义链5'-GGAGAGGAACTGGACTGGCTC-3'，反义链'-CCAGCCAAGGTTGAGGTTGCA-3';β-actin:正义链5'-GTCGAGACACGATGGTGAAGGT-3'，反义链5'-TTCTCAGCCACCGTGCCG-3'。扩增条件:第一步:95℃ ×30 s;第二步:95℃ ×5 s，60℃ ×10 s，72℃ ×15 s，循环35 次。

1.7 统计学分析 采用SPSS13.0 for windows统计软件进行处理。数据以x±s表示，各组数据进行正态性和方差齐性检验，两样本的均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 MicroRNA-29 a对VSMCs活力的影响 结果显示，与阴性对照组和空白对照组相比较，MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组VSMCs体外增殖能力明显被抑制 (P＜0.05)，而阴性对照组与空白对照组之间比较无显著差异 (P＞0.05)，说明抑制MicroRNA-29 a的表达可以抑制 VSMCs的增殖(见表1)。

表1 MicroRNA-29 a对VSMCs体外增殖的影响(x ± s，n=6)

2.2 MicroRNA-29 a对VSMCs迁移能力的影响 结果显示，在0 h时划痕宽度均为(380.71±9.12)μm。随着时间的延长，与阴性对照组和空白对照组比较，MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组VSMCs迁移能力明显被抑制(P＜0.05)，而空白对照组与阴性对照组相比无明显差异(P＞0.05)，说明抑制MicroRNA-29 a的表达能显著抑制VSMCs的迁移(见表2)。

2.3 MicroRNA-29 a对MMP-9、MMP-2和PCNA mRNA表达的影响 转染48 h后，与阴性对照组和空白对照组比较，MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组MMP-9、MMP-2和PCNA mRNA表达明显被抑制(P＜0.05)，而空白对照组与阴性对照组相比无明显差异(P＞0.05)(见图1)。

2.4 MicroRNA-29 a对MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表达的的影响 作用48 h，Western印迹检测结果发现，与阴性对照组和空白对照组比较，MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组 MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表达均明显被抑制，而空白对照组与阴性对照组相比无明显差异(见图2)。

表2 MicroRNA-29 a对VSMCs迁移能力的影响(μm，x ± s，n=6)

图2 Western印迹检测microRNA-29a对VSMC中MMP-9、MMP-2和PCNA表达的影响

3 讨论

目前已经发现多个miRNA在VSMC中特异表达，并能调节VSMC的增殖和迁移，从而影响高血压和动脉粥样硬化斑块的形成过程。研究发现MicroRNA145是正常血管壁和血管平滑肌细胞中最多表达的MicroRNA，并能抑制血管新生内膜的生长〔1〕。Elia等〔2〕发现 Microrna145 和 Microrna143 对血管平滑肌的表型及分化有调节作用。Liu等〔3〕发现低表达的MicroRNA221和MicroRNA222基因能抑制血管平滑肌细胞的增殖。MicroRNA-29 a是一个遗传上高度保守的miRNA，在体内几乎所有的细胞内表达。已经证实MicroRNA-29 a参与肿瘤形成、免疫炎症反应、细胞因子分泌、葡萄糖代谢等过程。在心血管系统中MicroRNA-29 a不但与心脏纤维化相关，还与动脉粥样硬化的形成有关〔4〕，但MicroRNA-29 a是否参与VSMC的增殖和迁移尚不见报道。本研究说明MicroRNA-29 a可以影响VSMC的增殖和迁移。PCNA是一种分子量为36 kD的核蛋白，在VSMC的增殖中起重要作用，当VSMC发生增殖时，PCNA的表达量明显升高〔5〕。本文表明MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组PCNA的表达也被明显抑制。基质金属蛋白酶(MMPs)通过降解ECM，导致血管中层VSMC迁移至内膜，这与AS斑块形成病理过程密切相关〔6〕。本研究结果表明，MicroRNA-29 a反义寡核苷酸组能更有效地抑制MMP-2和MMP-9的表达。

1 ChengY，Liu X，Yang J.MicroRNA-145，a novel smooth muscle cell phenotypic-marker and modulator，controls vascular neointimal lesion formation〔J〕.Circ Res，2009;105(2);158-66.

2 Elia L，Quintavalle M，Zhang J，et al.The knockout of miR-143 and miR-145 alters smooth muscle cell maintenance and vascular homeostasis in mice:correlates with human disease〔J〕.Cell Death Differ，2009;16(12):1590-8.

3 Liu X，Cheng Y，Zhang S，et al.A necessary role of miR-221 and miR-222 in vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia〔J〕.Circ Res，2011;104(4):476-87.

4 van RE，Sutherland LB，Thatcher JE，et al.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2008;105:13027-32.

5 Li GH，Chen YF，Stacey SK，et al.Estrogen attenuates integrin-3-dependent adventitial fibroblast migration after inhibition of osteopontin production in vascular smooth muscle cell〔J〕.Circulation，2000;101:2949-55.

6 Johnson JL.Matrix metalloproteinases:influence on smooth muscle cells and atherosclerotic plaque stability〔J〕.Expert Rev Cardiovasc Ther，2007;5(2):265-82.