高效液相色谱法同时测定牛奶中的香兰素与乙基香兰素

林灵超，吴方圆

(浙江福立分析仪器有限公司，浙江温岭 317500)

香兰素与乙基香兰素是人工合成的香精，可增强食品口感，使其清香宜人[1]，是食品添加剂行业中不可缺少的重要原料，可直接应用于化妆品、香皂、香烟、糕点、糖果、饼干、奶粉以及烘烤食品中[2]。但大剂量使用香兰素可以导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至损伤肝、肾，对人体有较大危害。

常见香兰素与乙基香兰素的分析方法有气相色谱法[3–4]、分光光度法[5–6]、高效液相色谱(HPLC)法[7]、液相色谱 – 质谱联用[8]及其它方法[9–11]。笔者采用HPLC法同时测定香兰素与乙基香兰素，通过对牛奶样品的简单处理和流动相的优化，使得方法操作简单，精密度高，重复性好，可用于牛奶中香兰素与乙基香兰素的日常检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：FL2200–II型，浙江福立分析仪器有限公司；

色谱柱：Ultimate XB–C18型(4.6 mm×250 mm，5μm)，月旭材料科技(上海)有限公司；

超声波清洗器：HS 2060型，浙江福立分析仪器有限公司；

电子分析天平：JA 2004型，上海雷韵公司；

甲醇：色谱纯，美国J. T. Baker 公司；

磷酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；

盐酸、氢氧化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

香兰素、乙基香兰素标准样品：含量均不小于99.9%，国家标准物质研究中心；

牛奶样品：批号为20121001，市售；

实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液的制备

分别取香兰素与乙基香兰素标准样品各1 mL，以甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，配制成100 mg／L的混合标准储备液。精密移取0.5 mL混合标准储备液，以流动相溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成0.5 mg／L的混合标准溶液，过滤，备用。

1.3 样品溶液的配制

称取牛奶样品5 g，以25 mL 50℃热水溶解，超声 10 min，用 5 mol／L 盐酸溶液调节至 pH 1.7，放置5 min，再用2 mol／L NaOH溶液调节至pH 4.5，此时溶液变为悬浊液，将此悬浊液转移至50 mL容量瓶中，用纯水定容至标线后倒入漏斗，用快速定性滤纸过滤，弃去初滤液，收集中间滤液，充分摇匀，过滤，备用。

1.4 色谱条件

流动相：甲醇–0.01 mol／L磷酸溶液(体积比为 30∶70)；流速：1.0 mL／min；检测波长：276 nm ；柱温：30℃；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 流动相组成

考察了乙腈–乙酸、乙腈–磷酸二氢钾、甲醇–磷酸等流动相，虽然乙腈的洗脱能力强于甲醇，但其毒性较大，而且香兰素与乙腈香兰素的色谱峰形、分离度均不符合分析要求；而用甲醇–磷酸体系可以得到标准对称的色谱峰形，因此选择甲醇–磷酸体系作为流动相。

2.2 前处理方法

牛奶中的蛋白质含量较高，因此样品要先用50℃热水超声提取，再经酸沉淀蛋白后进行测定。实验结果表明：本方法加标回收率大于98%，且操作简单，可以满足牛奶中香兰素与乙基香兰素的检测要求。

2.3 色谱图

在1.4色谱条件下香兰素与乙基香兰素标准溶液及牛奶样品的高效液相色谱图见图1，由图1可知，香兰素与乙基香兰素分离良好、峰形对称，符合分析要求。

2.4 精密度试验

精密吸取香兰素、乙基香兰素混合标准溶液20 μL，按照1.4色谱条件连续进样6次，分别测定香兰素和乙基香兰素的色谱峰面积，测定结果列于表1。由表1可知，香兰素与乙基香兰素色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为1.09%，0.89%，表明仪器的精密度良好。

表1 香兰素与乙基香兰素标准样品色谱峰面积测定结果

2.5 线性关系、检出限

分别精密吸取混合标准溶液 0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 mL于10 mL容量瓶中，以流动相稀释至标线，摇匀，制得不同浓度的混合标准溶液，分别精密吸取20 μL，按1.4色谱条件进样测定色谱峰面积，以标准品浓度X(μg／mL)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，进行线性回归，在0.5～10μg／mL的进样范围内，香兰素的线性方程为Y=6.656×10–6X+0.193，r2=0.9997；乙基香兰素的线性方程为Y=8.022×10–6X+0.194，r2=0.9997，表明二者浓度与色谱峰面积线性关系良好。

将混合标准溶液以不同倍数稀释后进行测定，以峰高为基线噪音3倍时的质量浓度为检出限，测得香兰素和乙基香兰素的检出限分别为5.68 μg／L和12.8 μg／L。

2.6 重复性试验

精密称取同一牛奶样品6份，照上述样品制备方法制备，按1.4色谱条件进样测定香兰素与乙基香兰素的含量，测定结果见表2。由表2可知，牛奶样品中香兰素与乙基香兰素平均含量为2.014 mg／kg和1.990 mg／kg，测定结果的相对标准偏差分别为1.35%，1.57%。表明方法测量重复性良好。

表2 牛奶样品中香兰素与乙基香兰素含量测定结果

2.7 加标回收试验

取牛奶样品9份，每份为5 g，每3份为一组，每组分别加入混合标准溶液4，5，6 mL，按照1.3样品溶液的配制方法进行提取和定容后，按1.4色谱条件测定，测定结果见表3。由表3可知，实验所得香兰素、乙基香兰素平均加标回收率为99.8%，98.4%；测定结果的相对标准偏差分别为1.06%，2.31%。

表3 加标回收试验结果

3 结语

牛奶样品经50℃热水超声提取并酸沉淀处理后，用HPLC法同时测定其中的香兰素与乙基香兰素，方法简便，准确度高，重现性好，可以作为日常的检测。

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