江苏省部分地区淡水产品中弧菌菌群及其致病性分析

高 璐，杭 莉，杨振泉，唐 伟，高 崧，方维明

2.扬州大学兽医学院，扬州 225009；

3.泰州市疾病预防控制中心，泰州 225300；

4.泰州市出入境检验检疫局，泰州 225300

弧菌是水生动物弧菌病的病原体，是一群菌体短小、杆状或弯曲成弧状的革兰氏阴性菌，广泛分布在自然界中，以海水、淡水和水生动物身体居多，其中12种与人类肠内、肠外感染有关［1］，分别是霍乱弧菌（V.cholerae）、拟态弧菌（V.mimicus）、梅契尼柯夫弧菌（V.metschnikovii）、霍利斯弧菌（V.hollisae）、海鱼弧菌（V.damsela）、河流弧菌（V.fluvialis）、弗尼斯弧菌（V.furnissii）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、创伤弧菌（V.vulnificus）、辛辛那提弧菌（V.cincinnatiensis）和鲨鱼弧菌（V.carchariae）。在这12种致病性弧菌中，危害最大、最常见的是副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌，其中O1型霍乱弧菌被WHO定为检疫菌，副溶血弧菌是水产品国际检测菌种［2］。

目前海水产品中以副溶血弧菌、霍乱弧菌为主的致病性弧菌污染情况，海水、海洋沉积物中弧菌的分布和菌群多样性分析屡见报道，淡水产品中副溶血弧菌的污染情况也偶有报道［3］，但淡水产品中弧菌污染情况及菌群多样性却未见报道。本研究主要了解江苏省部分地区淡水产品中弧菌菌群的分布和分离株的致病性，为建立江苏省水产品尤其是淡水产品中弧菌的膳食暴露水平及危险评估提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源：副溶血性弧菌标准菌株ATCC33847（tdh＋trh－）由上海疾病预防与控制中心馈赠，本实验室保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 TCBS琼脂购于杭州微生物试剂有限公司；我萋氏培养基购于青岛海博生物技术公司；PCR所用生物试剂（10×Buffer、RNase、Taq酶、d NTPs、DNA Marker）为上海生工生物工程技术有限公司产品。

SPX－250－250B－Z型生化培养箱（上海博讯），PTC－100 PCR仪（美国 MJ公司），DYY－8B型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂），TG16－WS型高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司），GELDOCXR凝胶成像系统（BIO－RAD公司），CO2培养箱（Heal Force公司）。

1.2 样品采样 从江苏省连云港市、扬州市、常州市、泰州市的超市及农贸市场，按随机采样原则采集55份鲜活淡水产品，其中鱼类26份，贝类3份，蟹类10份，虾类16份。样品取整只，装入样品袋，封口，贴上标签，4℃冰箱保存，24～36 h内送回实验室分析。

1.3 弧菌分离与生化鉴定 样品处理和部分生化鉴定试验参照GB/T 4789.7－2008《食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验》和《食品卫生微生物检验标准手册》进行。

1.4 弧菌菌群的分子鉴定

1.4.1 弧菌基因组 DNA 提取：参照文献［4］或《精编分子生物学实验指南》的CTAB法提取弧菌分离株基因组DNA。

至此，方向机单元软件升级操作完成，故障代码“B200500记录无效”记录可以删除。接下来需要写入参数，对方向机进行参数化操作。

1.4.2 引物设计：分别选取副溶血性弧菌、溶藻弧菌的种特异性tlh［5］基因、HSP60基因［6］作为靶基因对TCBS菌群分离株进行分群；再利用细菌16S－r DNA通用引物［7］对其余的分离株进行16S－r DNA PCR扩增分析。同时对副溶血性弧菌分离株的致病基因耐热性溶血素基因（tdh）［4］和耐热性溶血素相关毒素基因（trh）［4］进行检测。所有引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。引物序列见表1。

表1 弧菌PCR检测引物序列Tab.1 Oligonucleotide primers used for PCR

1.4.3 PCR 扩增：根 据相 应文献［4－7］中的 PCR 反应体系和扩增程序进行PCR扩增，扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.4 菌株16S r DNA 序列分析：16S r DNA PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定其片段大小为1500bp，送上海生工生物工程技术有限公司进行测序，将测序所得序列经NCBI比对后，通过Blast程序与GenBank中核酸数据库进行对比分析（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast），选取同源性高的菌株，采用Clusalx软件对比分析，运用Mega4.0构建系统发育树。

1.5 神奈川（KP）试验 将我妻氏基础培养基按说明书加超纯水煮沸，冷却至45℃左右时，加入新鲜兔血红细胞10%，混合均匀，倾注平皿；将各分离株纯培养物点种于血琼脂表面，37℃培养16 h，观察溶血现象，如有溶血现象则说明KP试验结果阳性。1.6 小鼠肠致病性的测定 对神奈川试验阳性且溶血圈大于4 mm的弧菌分离株进行小鼠肠致病性的测定，弧菌分离株LBS液体培养基培养16 h后于4℃，8 000 r/mim离心5 min，收集菌体，根据预实验平板计数结果用PBS调整成108CFU/m L的菌悬液对6周龄雌性ICR小鼠进行灌胃0.5 m L，每个菌株灌胃5只小鼠，PBS灌胃作为阴性对照，观察小鼠的发病和死亡情况，灌胃24 h后解剖小鼠取小肠观察病变情况。取小鼠胃下20 cm左右肠段，测定长度L（cm），放在平皿中称取其重量 W1（mg），然后放在烘箱内80℃烘干12 h后称取重量W2（mg），按公式FA＝（W1－W2）/L计算每只小鼠肠内液体累积率FA（mg/cm），用每组小鼠肠内液体累积率（FA）平均值反映菌株的肠致病性。

2 结 果

2.1 样品中弧菌的分离结果 样品通过增菌后在TCBS平板上生长的大多为表面光滑、呈圆形的黄色或蓝绿色菌落，直径1～3 mm，按比例随机挑取不同形态和颜色的菌落256株，经纯化后制成15%甘油菌悬液－70℃保存备用。对纯化后的分离株进行生化实验，结果表明，所有分离株均是革兰氏阴性菌；243株分离株为氧化酶试验阳性；嗜盐性试验中3株0%阳性、所有分离株3%和6%均为阳性、106株10%阳性；三糖铁试验中8株TSI斜面变黄底部颜色不变、90株斜面不变底部发黄、11株培养基颜色不变、17株培养基变黄且产气、4株培养基变黄且底部发黑、126株培养基全部变黄。

2.2 分离株的PCR结果 对于所有分离株分别用副溶血弧菌的种特异性引物tlh和溶藻弧菌的特异性引物hsp60进行PCR扩增鉴定。tlh基因阳性的菌株在450 bp处出现特异性扩增条带，256株分离株中共有83株出现tlh基因阳性条带，如图1所示；hsp60基因阳性的菌株在560 bp处会出现特异性条带，本试验中共有130株分离株有此条带，见图2。

图1 副溶血弧菌tlh基因的PCR扩增Fig.1 Molecular identification of V.parahaemolyticus isolates by amplifying tlh geneM：DNA marker；1：Negative control；2－5：Vibrio isolates

图2 溶藻弧菌HSP60基因的PCR扩增Fig.2 Molecular identification of V.alginolyticus isolates by amplifying HSP60 geneM：DNA marker；1－3：Vibrio isolates；4：Negative control

2.3 弧菌分离株的16S r DNA序列Blasten结果对基因tlh和HSP60阴性分离株（共43株）进行16S r DNA扩增，扩增片段大小为1 500 bp的PCR产物送上海生物工程有限公司测序，序列在Gen－Bank上进行Blasten分析。结果显示，43株分离株中共有9种弧菌，其中，Vibrioparahaemolyticus2株、Vibrioalginolyticus1株 、Vibrioharveyi8 株、Vibrioazureus5株、Vibriometschnikovii3株、Vibrioaestuarianus3株 、Vibrioowesii1株 、Vibrio diazotrophicus1株和Vibrionatriegens1株。此外，有18株分离菌株属于弧菌属相近属的细菌，如：Leclerciasp3株，Pseudomonasfluorescens6株和Aeromonasenteropelogenes9株。部分分离菌株测序结果见表2。

表2 部分分离株的16S r DNA序列Blasten结果Tab.2 Blasten results of 16S r DNA of Vibrio isolates

2.4 淡水产品中弧菌的检出率 随机采集的4类淡水产品共55份，共分离出256株弧菌分离株。根据生化试验结果、特异性基因分析及16S r DNA PCR结果分析，55份样品中共分离出9种弧菌，其检出率见表3。

由表3可知，我省部分地区淡水产品中弧菌的污染也较为普遍，弧菌菌群结构具有丰富的多样性，其中副溶血弧菌、溶藻弧菌是优势菌群。不同地区和不同样品中的弧菌菌群和弧菌检出率有所差异，连云港地区淡水产品中弧菌的检出率明显高于扬州、常州、泰州地区，且其弧菌的种类明显多于其他地区；这可能是由于连云港属于沿海地区而扬州、常州、泰州是内陆地区；鱼、虾中弧菌的检出率和弧菌种类明显高于贝、蟹。

表3 不同地区不同样品中弧菌的检出率Tab.3 Detection rate of Vibrio in samples

2.5 弧菌分离株的致病性 对分离株进行tdh、trh基因PCR扩增。结果显示所有分离株均未扩增出tdh、trh条带，说明这些副溶血弧菌分离株均不携带tdh、trh致病性相关基因。

神奈川（KP）试验结果显示，256株分离株中35株有明显透明溶血圈（直径＞2mm），占所有分离株的15.02%。其中弧菌中V.parahaemolyticus12株，V.alginolyticus13株，V.harveyi1株，V.aestuarianus2株，V.azureus3 株，V.metschnikovii1株 ，V.owensii1株 。

小鼠肠致病性实验结果显示，所有灌胃小鼠均没有死亡，但所有分离株灌胃小鼠均出现不同程度的小肠积水、肠壁充血效应（变红），有的肠腔内出现黄色或淡红色积水，肠壁变薄，肠液累积率（FA）见表4。由表4可见，所有弧菌的肠液累积率均高于阴性对照组。经SPSS软件统计学分析，有6株分离株肠液累积率均显著大于阴性对照组（P＜0.05），表明大多数的KP＋分离株能引起小鼠小肠积水；与阳性对照菌株 ATCC33837（tdh＋trh－）相比，有四株分离株（71、92、203、214）的肠液累积率与其相近，差异不显著，说明这4个分离株能引起小鼠较严重的肠积水现象。相关性分析显示，肠液累积率与溶血圈的大小没有明显的相关性。

表4 弧菌分离株肠致病性测定结果Tab.4 Determination result of intestinal pathogenic for Vibrio isolates

3 讨 论

弧菌是影响水产品安全的重要因子，本研究对江苏省部分地区的淡水产品进行弧菌菌群的分析，结果显示，样品中弧菌的总检出率达96.4%（53/55），包括9个弧菌种和3个非弧菌种，其中以副溶血弧菌（74.55%）、溶藻弧菌（85.45%）为主要菌群，表明江苏省淡水产品中弧菌污染率较高，弧菌种类多样，存在食品安全风险。本研究中检出的3个非弧菌种是Leclerciasp，Pseudomonasfluorescens和Aeromonasenteropelogenes，这表明采用TCBS培养基还可以分离出其他细菌，有文献［8］将其所分离得到的细菌统称为“TCBS类群细菌”，也与 Wang［9］等人的研究结果基本一致。因而，在生产实践及环境评价过程中，单纯通过测定TCBS菌群数以代表弧菌数量的做法，可能会导致弧菌数量的高估和错估，尤其是在淡水或咸淡水区域。为获取更加接近弧菌总数的真实值，应该在TCBS琼脂平板计数的同时，进行TCBS菌株的种属鉴定。

本研究结果显示，不同地区和不同样品中的弧菌菌群和弧菌检出率有所差异。从地区分布来看，连云港地区淡水产品中弧菌的检出率明显高于扬州、常州、泰州地区，提示淡水产品中弧菌的携带情况可能存在一定的区域性。Yang等［4］研究表明江苏省不同地区副溶血性弧菌的分布也存在一定的差异。从不同种类样品弧菌的检出率来看，鱼、虾中弧菌的检出率和弧菌种类明显高于贝、蟹，表明鱼、虾可能是弧菌的优势寄生宿主。Yang等［4］研究表明在海产品中贝类、虾类的副溶血性弧菌携带率较高，但是本研究发现在淡水产品中鱼、虾的弧菌污染率较高。

副溶血弧菌是一种重要的食源性致病菌。目前的研究认为，副溶血弧菌的致病因子主要有耐热直接溶血毒素（TDH）、耐热直接相关溶血毒素（TRH）、不耐热溶血毒素（TLH），分别由相关的tdh、trh和tlh基因编码。TDH和TRH与副溶血弧菌的致病能力关系密切，大部分临床分离株都具有由TDH引发的神奈川现象（KP）［10］，只有少数环境和海产品分离株出现此现象。本研究分离到的副溶血弧菌均未检出tdh和trh基因，但仍有少量分离株表现出KP＋现象。揭示了tdh－菌株仍具有一定的致病风险。

本次从淡水产品中检出的弧菌分离株256株中共有35株能产生溶血现象，其中有明显溶血圈的分离株大多能引起小鼠肠道一定程度的积水现象，但与溶血圈的大小没有明显相关关系，且都没有致死小鼠。目前的研究［11］大多认为海产品中存在着弧菌引起的食物中毒风险，但本研究结果表明这些弧菌分离株具有一定的致病性，说明在淡水产品中也存在食物中毒的风险。因此，我们应倡导消费者养成科学健康的饮食习惯，加强卫生监督部门对餐饮业加工各环节的卫生监督，采取有效措施控制弧菌污染淡水产品是非常必要。

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