氯化镉对斑马鱼胚胎的发育毒性

鲁疆，王占洋，袁玉婷，许波，高永林，张波，郑秋生，，王振华，，*

1．石河子大学药学院新疆特种植物药资源教育部重点实验室，石河子832002

2．烟台大学生命科学学院，烟台264005

镉(Cd)是一种常见的环境毒物，目前发现其对人体没有任何生理作用。Cd的生物半衰期长达10～35 y，可在体内长期蓄积产生毒性。Cd污染不仅影响农作物的生长发育、产品及质量，还通过食物链的形式在动物和人类体内大量蓄积，危害动物和人类的健康及生命安全。Cd可以对人体肝、肾、骨骼、及生殖等多个系统产生毒害作用。妊娠期的妇女接触Cd，不仅会受到Cd的毒性作用，而且Cd可以透过胎盘屏障损害胎儿神经系统发育，导致胎儿发育不良，新生儿体质量下降。1971年国际环境会议将Cd列为环境污染物中最危险的5种物质之一。随着工业化进程的加速，Cd暴露对人类健康的影响日益引起人们的关注［1-2］。我国目前至少有16个省(自治区、直辖市)报导过职业或环境Cd暴露对健康的不良影响。因而，开展Cd毒性研究具有巨大的现实意义和社会价值。大量实验表明，Cd的毒性机制与细胞受氧化胁迫相关［3-4］。氧化应激诱导脂质过氧化，是鱼类暴露Cd后众所周知的生物学效应［5-7］。Stohs和Bagchi研究表明［8］，Cd诱导产生的抗氧化状态的变化，可能通过提高超氧阴离子自由基的产生和脂质过氧化反应，也有可能减少酶和非酶的抗氧化剂。Cd很可能触发氧化还原反应，产生自由基和活性氧(ROS)(包括 H2O2、O-2·、·OH 等)，ROS 的积累会损伤DNA、蛋白质和脂类［3］。ROS在信号通路转导和转录因子调控中发挥着重要作用［9］。适量的ROS很可能作为第二信使激活转录因子NF-kappa-B，但高浓度的ROS会损伤组织［10］。在正常情况下，ROS和其他自由基会被抗氧化系统、抗氧化物酶(CAT、SOD、GPx、GST等)及非酶的抗化剂(GSH)清除［11-13］。如果ROS的量超过了抗氧化系统的防御能力，氧化应激会导致鱼类组织细胞多种类型的损伤［14］。近期，大量研究开始关注Cd暴露后氧化应激对鱼类的影响［15-17］。胡蓉等［18］研究表明，Cd2+、Hg2+对鲫鱼胚胎发育和仔鱼均有毒害作用，且随Cd2+、Hg2+质量浓度的增大和染毒时间的延长，毒性效应不断增加。研究表明，Cd积累及其毒性效应会影响日本比目鱼的生长和抗氧化系统，减少中国沿海水域商业鱼类数量。Chow等［19］2008年研究表明，Cd诱导斑马鱼胚胎神经毒性抑制神经形成，从而减少神经元分化和轴突形成。Chow等［20］2009年研究表明，Cd暴露斑马鱼胚胎幼鱼眼视网膜分化细胞减少，视网膜神经节细胞轴突形成受损和视锥细胞缺乏，是引起眼球和视力受损的主要原因。Cd暴露后，鱼类将启动多种酶类和非酶的抗氧化机制来抵御氧化应激。例如，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽S-转移酶(GST)，它们可以解除重金属暴露的毒性作用，清除ROS，从而预防鱼类受氧化损伤［21-22］。

斑马鱼(Danio rerio)是已经被人们广泛接受并用于研究胚胎发育，遗传分析，毒理学和多种人类疾病的理想模式生物［23-24］。经济合作与发展组织(OECD)在1996年将斑马鱼胚胎发育的方法列为测定单一化学毒物的标准方法之一，并制定了详细的操作指南［25］。运用斑马鱼检验环境化学物的致畸效应，具有成本低、影响因素少、可重复性好、易操作、灵敏度高以及可观察多项毒性指标的特点，并可以此判断污染物的致毒机理。

近些年来，国内外大量研究报道了Cd毒性在实验动物肝、肾、骨骼及神经系统中与金属硫蛋白［26-27］、钙［28］、线粒体［29］及诱导氧化胁迫［30］的作用机理。但是关于Cd对胚胎发育的毒性及机制的相关报道极为少见，然而关于Cd诱导氧化应激对斑马鱼胚胎发育的影响仍未见报道。以斑马鱼为实验动物考察了氯化镉对斑马鱼胚胎发育的毒性作用，并初步探讨了氧化胁迫与Cd毒性的相关性，为进一步深入研究Cd发育毒性以及合理的临床干预提供参考依据。

1 材料与方法(M aterials and m ethods)

1．1 材 料

AB系斑马鱼成鱼由国家斑马鱼模式动物北方中心惠赠，由本实验室繁育保存。

E3 培养液含 0．17mmol·L-1KCl，5mmol·L-1NaCl，0．33mmol·L-1MgSO4，0．33mmol·L-1CaCl2，pH 7．4。

CdCl2纯度为99．0%，上海中秦化学试剂公司;丙二醛(MDA)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;GSH和GSSG检测试剂盒均为碧云天生物技术研究所;N-乙酰半胱氨酸(NAC)，麻醉剂Tricaine和活性氧荧光探针DCFH-DA均购自美国SIGMA公司;其他试剂均为国产分析纯。

1．2 方 法

1．2．1 鱼卵的收集

成年斑马鱼饲养于独立养殖单元(北京爱生)，水温(28．5±0．3)℃，盐度为450～500 μS，pH为7．0 ～7．5，光周期为14 h/10 h(光照/黑暗)，每日喂3次活丰年虾。在收集胚胎的前一天晚，将1条雌鱼和1条雄鱼移入交配盒，用隔板将其隔开，第2天光照1 h后移去隔板，观察产卵时间。于产卵后1 h收集受精卵，用E3培养液轻轻冲洗3次后，置于E3培养液中，28．5℃恒温光照培养箱中培养。

1．2．2 胚胎染毒实验

参照Vaughan等［31］的方法，收集受精后1 h(1 hpf)斑马鱼胚胎置于12孔细胞培养板中，10卵/孔，每孔加入2．0mL含不同浓度CdCl2的E3培养液，每处理组设胚胎80枚，另取80枚卵孵育于不含CdCl2的E3培养液作为正常对照。随后加盖封闭，置于28．5℃恒温光照培养箱内，让胚胎继续发育。每24 h更换一半E3培养液，并观察胚胎发育状况，至96 hpf。以卵凝结或心脏停跳作为胚胎死亡终点，记录胚胎和/或幼鱼的死亡、畸形及幼鱼孵化情况，计算死亡率、孵化率和畸形率:胚胎死亡率(%)=(死亡胚胎数量/总胚胎数量)×100;胚胎孵化率=(孵化的胚胎总数/总胚胎数量)×100;畸形率(%)=(畸形幼鱼数量/已孵化胚胎数量)×100。

1．2．3 NAC 干预实验

按1．2．2胚胎染毒方法，取1 hpf胚胎，胚胎暴露于含20mg·L-1CdCl2，或同时含有20mg·L-1CdCl2和10 mg·L-1NAC，或含有10mg·L-1NAC 的E3 培养液，同时设空白对照组。以卵凝结或心脏停跳作为死亡终点，在体式显微镜下观察至96 hpf，记录胚胎和/或幼鱼的死亡数、畸形数及幼鱼的孵化数，计算死亡率、畸形率和孵化率。

1．2．4 胚胎细胞凋亡观察

参照文献［32］的方法，收集1 hpf斑马鱼胚胎，按1．2．3 方法处理至24 hpf，更换为含5 mg·L-1吖啶橙(AO)的 E3培养液，28．5℃孵育 20 min，以不含AO的E3培养液洗涤3次，每次5 min，加入含0．016 mol·L-1Tricaine的 E3培养液处理1 min，麻醉胚胎后，在荧光显微镜(日本Nikon ECLIPSE 80i)下以蓝光激发，观察胚胎细胞凋亡情况并拍照。

1．2．5 胚胎活性氧水平测定

按1．2．3方法处理1 hpf胚胎3 h，E3培养液清洗胚胎3次后，更换为含20μmol·L-1DCFH-DA的E3培养液，于28．5℃孵育1 h，以E3培养液洗涤胚胎3次，吸净E3培养液，每处理选取20枚胚胎，加入预冷的200μL E3培养液后，电动组织匀浆器匀浆，匀浆液于4℃、10 000 g下离心4 min，取200μL上清液，加入96孔酶标板，于酶标仪(瑞士 Tecan Infinite M200，)测定荧光强度(激发波长485 nm，发射波长535 nm)。

1．2．6 MDA 含量测定

按1．2．3方法处理1 hpf胚胎3 h，每处理取胚胎20枚，转移到离心管中，以E3培养液洗涤胚胎3次，吸干表面液体，加入200μL E3培养液，电动组织匀浆器匀浆，匀浆液于4℃、10 000 g下离心10 min。取上清，按试剂盒说明书方法测定MDA含量。

1．2．7 GSH、GSSG 指标测定

按1．2．3方法处理1 hpf胚胎3 h，每处理取20枚胚胎，转移到1．5 mL离心管中，冰浴E3培养液洗涤3次，吸干表面液体，匀浆，4℃放置10min，4℃、10 000 g下离心10 min，取上清按照试剂盒说明书测定GSH和GSSG值。

1．2．8 统计学分析

所有实验均重复3次。实验数据采用平均值±标准差(mean±SD)表示，除特别说明外，结果均采用SAS 8．1统计软件进行单因素方差分析，P＜0．05表示差异具有显著性统计学意义。

2 结果(Results)

2．1 氯化镉对斑马鱼胚胎发育的毒性效应

图1 氯化镉对斑马鱼胚胎的毒性效应Fig．1 Toxic effects of CdCl2 on zebrafish embryos

斑马鱼胚胎于54 hpf开始孵化出膜，对照组至78 hpf孵化完全。10 ～30mg·L-1CdCl2处理后，斑马鱼胚胎孵化率降低，死亡率升高，呈浓度依赖性。30 mg·L-1CdCl2处理组至 96 hpf时胚胎死亡率达98．3%，且未有胚胎孵化。各组斑马鱼胚胎死亡均发生于24 hpf之前。采用线性回归分析法计算出CdCl2处理至96 hpf对斑马鱼胚胎的半数致死浓度(LC50)为 18．9 mg·L-1(R2=0．973)。

2．2 氯化镉对斑马鱼胚胎发育的致畸作用

10～25 mg·L-1CdCl2暴露对斑马鱼胚胎及幼鱼多个系统的发育产生明显影响，主要表现为鱼卵发育阻滞、心脏水肿、卵黄囊水肿和脊柱弯曲等多种发育异常(图3)。10～25 mg·L-1CdCl2处理后，幼鱼心脏水肿、脊柱弯曲及总畸形率升高(图2，图3)。采用线性回归分析法计算出CdCl2处理至96 hpf对斑马鱼胚胎的半数致畸浓度(EC50)为13．7 mg·L-1(R2=0．967)。

图2 氯化镉致斑马鱼胚胎的发育畸形率Fig．2 Developmentalmalformation rate of zebrafish embryos induced by CdCl2

图3 氯化镉致斑马鱼胚胎发育的典型畸形特征

2．3 抗氧化剂NAC对氯化镉发育毒性的干预作用

与对照组比较，20 mg·L-1CdCl2单独处理斑马鱼胚胎，致胚胎死亡率(图4)和畸形率(图5)均明显增加(P ＜0．01);采用 10 mg·L-1NAC 与 20 mg·L-1CdCl2联合处理斑马鱼胚胎，与单纯CdCl2处理组相比，胚胎死亡率(图4)和畸形率(图5)均明显降低(P ＜0．01)。与对照组比较，20 mg·L-1CdCl2单独处理斑马鱼幼鱼体长(图6)明显缩短(P＜0．05);采用10 mg·L-1NAC 与 20 mg·L-1CdCl2联合处理斑马鱼胚胎，与单纯氯化镉处理组相比，斑马鱼幼鱼体长(图6)明显增长(P＜0．05)。表明NAC对CdCl2所致的斑马鱼胚胎发育毒性有一定保护作用。

图4 NAC干预氯化镉对斑马鱼胚胎的毒性效应Fig．4 NAC intervened toxic effect of CdCl2 on zebrafish embryos

2．4 氯化镉导致斑马鱼胚胎细胞的异常凋亡

图5 NAC干预氯化镉致斑马鱼胚胎的总畸形率Fig．5 NAC intervened total aberation rate of zebrafish embryos caused by CdCl2

图6 NAC干预氯化镉对斑马鱼胚胎体长的影响Fig．6 NAC intervened short snout-vent length of zebrafish embryos caused by CdCl2

斑马鱼胚胎经吖啶橙染色后，凋亡细胞呈现亮绿色荧光。正常组胚胎卵黄囊部位可见大量深染凋亡细胞，其他部位仅见少量深染细胞(图7A)。20mg·L-1CdCl2处理后，除卵黄囊部位见大量深染细胞外，头部和尾部亦可见大量深染细胞(图7B)，表明CdCl2处理可能对中枢神经系统发育有一定影响。采用10 mg·L-1NAC 与20 mg·L-1CdCl2联合处理斑马鱼胚胎后，仅见少量凋亡细胞(图7C)，表明NAC对CdCl2诱导的斑马鱼胚胎细胞凋亡有明显的抑制作用。

图7 氯化镉对斑马鱼胚胎细胞凋亡的影响

2．5 氯化镉暴露导致斑马鱼胚胎氧化胁迫损伤

20mg·L-1CdCl2处理斑马鱼胚胎后，胚胎ROS水平(图8A)、胚胎脂质过氧化产物丙二醛(MDA)水平(图8B)均明显高于对照组(P ＜0．01)，GSH/GSSG 水平明显低于对照组(P＜0．01)(图8C)，表明CdCl2处理致斑马鱼胚胎发生了氧化应激损伤。采用10 mg·L-1NAC与20mg·L-1CdCl2共同处理斑马鱼胚胎，可明显下调胚胎组织中ROS和MDA水平(P＜0．05)(图8A和B)，上调 GSH/GSSG 水平(P ＜0．05)(图8C)，表明NAC对CdCl2所致斑马鱼胚胎氧化应激损伤有一定防护作用。

3 讨论(Discussion)

Cd是一种强的脂质过氧化作用诱导剂，脂质过氧化作用可导致细胞膜通透性增强，造成细胞内外的稳态失调，从而引起一系列损害。Cd能够降低肝脏中谷胱甘肽含量，有效抑制POD、SOD和CAT活性，改变细胞内的抗氧化系统，使自由基不能及时被清除，造成机体内大量自由基积累。GSH在清除细胞内H2O2、O-2·和LOOH中扮演了重要角色，同时GST能够催化外源性毒物与GSH反应结合，以保护组织不受氧化胁迫损伤［33］。大量的 ROS会激活caspase依赖型途径，诱导细胞凋亡。而NAC作为抗氧化剂易进入细胞，脱乙酰基后成为谷胱甘肽前体，能促进还原型谷胱甘肽的合成，而谷胱甘肽氧化-还原循环在机体内具有许多功能，是组织抗氧化损伤的重要内源性防御机制。

图8 氯化镉对斑马鱼胚胎氧化胁迫状态的影响Fig．8 Effect of CdCl2 on oxidative stress status of zebrafish embryos

本研究表明，斑马鱼胚胎暴露于CdCl296 h后，胚胎的死亡率、畸形率均明显升高，CdCl2处理可致胚胎凋亡细胞明显增多，幼鱼体型短小。幼鱼头部和尾部可见大量细胞凋亡，表明CdCl2处理可能对中枢神经系统发育有一定影响。Krumschnabel等［34］-12010年研究发现，Cd可以诱导虹鳟鱼细胞坏死性凋亡。Risso-de Faverney等［35］2004 年研究表明，Cd通过线粒体途径诱导虹鳟鱼肝细胞氧化胁迫，进而导致细胞凋亡。Chen等［36］研究发现，Cd诱导ROS产生，进而激活雷帕霉素(mTOR)信号通路，活化胰岛素生长因子受体(IGFR/PI3K)，抑制腺苷酶活化蛋白激酶(PTEN/AMPK)，导致神经细胞凋亡。Long等［37］研究发现，ABCC5/MRP5 是一种有机阴离子载体，参与机体防御和细胞信号转导。ABCC5在斑马鱼胚胎发育和解除重金属(Cd、Pb等)毒性中扮演了重要角色。显性失活的ABCC5会引起斑马鱼胚胎发育阻滞，而Cd、Pb和Hg等重金属暴露致斑马鱼胚胎 ABCC5表达上调。本研究中，较CdCl2的单独处理组，NAC与CdCl2共同处理组中斑马鱼幼鱼体长明显增长，活性氧水平和MDA含量明显降低。这说明，Cd导致斑马鱼胚胎发育阻滞，可能与ROS诱导ABCC5表达相关。进一步研究表明，CdCl2染毒可致斑马鱼胚胎ROS水平和脂质过氧化水平明显升高，降低 GSH/GSSG比率，证实CdCl2暴露可致胚胎发生严重的氧化应激损伤。细胞的正常代谢可产生各种ROS，过多的ROS会导致这一生理平衡失调，可引起细胞的氧化应激、蛋白质变性、脂质过氧化产物 MDA增加以及 DNA断裂［38-41］;MDA为体内脂质过氧化产物，GSH是体内含巯基的非蛋白化合物，具有保护酶分子和蛋白质免受内源或外源性氧化损伤，二者是评价细胞内氧化还原状态的重要指标。CdCl2可造成斑马鱼胚胎氧化应激，影响胚胎正常发育，甚至造成死亡。应用抗氧化剂NAC可明显拮抗CdCl2的发育毒性，胚胎孵化率显著升高，畸形率明显降低，胚胎凋亡细胞也明显减少，幼鱼体型增长;与氧化胁迫相关的胚胎ROS和MDA明显降低，而GSH/GSSG比值明显升高。以上数据表明，抗氧化剂NAC可以有效保护Cd暴露造成斑马鱼胚胎的发育毒性，进一步表明CdCl2对斑马鱼胚胎的发育毒性作用与氧化应激相关。Hsu等［42］近期发现，斑马鱼胚胎暴露于Cd中可致Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因表达下调，进一步影响DNA错配修复基因的表达。然而，生物体内氧化还原平衡状态的调控依赖一套复杂的ROS生成和清除系统，Cd暴露是否仅仅作用于ROS清除系统，又或者也作用于ROS生成系统，尚待更完善的研究以揭示。

［1］ Takenaka S，Karg E，Kreyling W G，et al．Fate and toxic effects of inhaled ultrafine cadmium oxide particles in the rat lung［J］．Inhalation Toxicology，2004，16(s1):83-92

［2］ Daston G P．Toxic effects of cadmium on the developing rat lung．Ⅱ．Glycogen and phospholipid metabolism［J］．Journal of Toxicology and Environmental Health，1982，9(1):51-61

［3］ López E，Arce C，Oset-Gasque M J，et al．Cadmium induces reactive oxygen species generation and lipid peroxidation in cortical neurons in culture［J］．Free Radical Biology and Medicine，2006，40(6):940-951

［4］ Pathak N，Khandelwal S．Oxidative stress and apoptotic changes in murine splenocytes exposed to cadmium［J］．Toxicology，2006，220(1):26-36

［5］ Roméo M，Bennani N，Gnassia-Barelli M，et al．Cadmium and copper display different responses towards oxidative stress in the kidney of the sea bass Dicentrarchus labrax［J］．Aquatic Toxicology，2000，48(2-3):185-194

［6］ Pandey S，Ahmad I，Parvez S，et al．Effect of endosulfan on antioxidants of freshwater fish Channa punctatus Bloch:1．Protection against lipid peroxidation in liver by copper preexposure［J］．Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2001，41(3):345-352

［7］ Sayeed I，Parvez S，Pandey S，et al．Oxidative stress biomarkers of exposure to deltamethrin in freshwater fish，Channa punctatus Bloch［J］．Ecotoxicology and Environmental Safety，2003，56(2):295-301

［8］ Stohs SJ，BagchiD．Oxidativemechanisms in the toxicity of metal ions［J］．Free Radical Biology＆ Medicine，1995，18(2):321-336

［9］ Flora SJ，MittalM，Mehta A．Heavymetal induced oxidative stress＆its possible reversalby chelation therapy［J］．Indian Journal of Medical Research，2008，128(4):501-523

［10］ Valko M，Leibfritz D，Moncol J，et al．Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease［J］．International Journal of Biochemistry and Cell Biology，2007，39(1):44-84

［11］ Basha P S，Rani A U．Cadmium-induced antioxidant defense mechanism in freshwater teleost Oreochromis mossambicus(Tilapia)［J］．Ecotoxicology and Environmental Safety，2003，56(2):218-221

［12］ Hansen B H，Rφmma S，GarmoФ A，et al．Induction and activity of oxidative stress-related proteins during waterborne Cd/Zn-exposure in brown trout(Salmo trutta)［J］．Chemosphere，2007，67(11):2241-2249

［13］ Messaoudi I，Barhoumi S，Saïd K，et al．Study on the sensitivity to cadmium of marine fish Salaria basilisca［J］．Journal of Environmental Sciences，2009，21(11):1620-1624

［14］ Barata C，Varo I，Navarro JC，et al．Antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in the freshwater cladoceran Daphnia magna exposed to redox cycling compounds［J］．Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology＆ Pharmacology，2005，140(2):175-186

［15］ Shi H，SuiY，Wang X，etal．Hydroxyl radical production and oxidative damage induced by cadmium and naphthalene in liver of Carassius auratus［J］．Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology＆Pharmacology，2005，140(1):115-121

［16］ Atli G，Alptekin O，Tükel S，et al．Response of catalase activity to Ag+，Cd2+，Cr6+，Cu2+and Zn2+in five tissues of freshwater fish Oreochromis niloticus［J］．Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology＆ Pharmacology，2006，143(2):218-224

［17］ Xu Z，Bai S．Effects ofwaterborne Cd exposure on glutathionemetabolism in Nile tilapia(Oreochromis niloticus)liver［J］．Ecotoxicology Environmental Safety，2007，67(1):89-94

［18］ 胡蓉，谢玉华，唐正义．汞镉离子对鲫鱼胚胎发育和仔鱼的毒性效应［J］．安徽农业科学，2010，38(34):19446-19448，19458 Hu R，Xie Y H，Tang Z Y．Toxic effects of Hg2+and Cd2+on embryo developmentand larva fish of Carassius auratus［J］．Journal of Anhui Agricultural Sciences，2010，38(34):19446-19448，19458(in Chinese)

［19］ Chow E S，HuiM N，Lin CC，etal．Cadmium inhibits neurogenesis in zebrafish embryonic brain development［J］．Aquatic Toxicology，2008，87(3):157-169

［20］ Chow E S，Hui M N，Cheng CW，et al．Cadmium affects retinogenesis during zebrafish embryonic development［J］．Toxicology and Applied Pharmacology，2009，235(1):68-76

［21］ Asagba SO，Eriyamremu G E，Igberaese M E．Bioaccumulation of cadmium and its biochemical effecton selected tissues of the catfish［J］．Fish Physiology and Biochemistry，2008，34(1):61-69

［22］ Ruas C B，CarvalhoúC S，de Araújo H S，et al．Oxidative stress biomarkers of exposure in the blood of cichlid species from a metal-contaminated river［J］．Ecotoxicology Environmental Safety，2008，71(1):86-93

［23］ Hill A J，Teraoka H，Heideman W，et al．Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity［J］．Toxicological Sciences，2005，86(1):6-19

［24］ Spitsbergen JM，Kent M L．The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--Advantages and current limitations［J］．Toxicology Pathology，2003，31(s1):62-87

［25］ Braunbeck T，BöttcherM．OECD Guideline for the Testing of Chemicals［EB/OL］．(2006-05-30)［2013-11-21］．http://www．oecd．org/chemicalsafety/testing/36817242．pdf

［26］ Dar S，Shuja R N，Shakoori A R．A synthetic cadmium metallothionein gene(PMCd1syn)of Paramecium species:Expression，purification and characteristics of metallothionein protein［J］．Molecular Biology Reports，2013，40(2):983-997

［27］ Onodera A，TaniM，Michigami T，etal．Role ofmegalin and the soluble form of its ligand RAP in Cd-metallothioneinendocytosis and Cd-metallothionein-induced nephrotoxicity in vivo ［J］．Toxicology Letters，2012，212(2):91-96

［28］ Miura S，Takahashi K，Imagawa T，et al．Involvement of TRPA1 activation in acute pain induced by cadmium in mice［J］．Molecular Pain，2013，9(1):7-16

［29］ Liu D，Yang J，Wang L．Cadmium induces ultrastructural changes in the hepatopancreas of the freshwater crab Sinopotamon henanense［J］．Micron，2013，47:24-32

［30］ Chang K C，Hsu C C，Liu S H，et al．Cadmium induces apoptosis in pancreaticβ-cells through a mitochondria-dependent pathway:The role of oxidative stress-mediated c-Jun N-terminal kinase activation［J］．PLOSONE，2013，8(2):e54374，doi:10．1371/journal．pone．0054374

［31］ Vaughan M，van Egmond R．The use of the zebrafish(Danio rerio)embryo for the acute toxicity testing of surfactants，as a possible alternative to the acute fish test ［J］． ATLA-Alternatives Laboratory Animals，2010，38(3):231-238

［32］ Chan PK，Cheng SH．Cadmium-induced ectopic apoptosis in zebrafish embryos［J］．Archives of Toxicology，2003，77(2):69-79

［33］ van der Oost R，Beyer J，Vermeulen N PE．Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment:A review ［J］．Environmental Toxicology and Pharmacology，2003，13(2):57-149

［34］ Krumschnabel G，Ebner H L，Hess MW，et al．Apoptosis and necroptosis are induced in rainbow trout cell lines exposed to cadmium ［J］．Aquatic Toxicology，2010，99(1):73-85

［35］ Risso-de Faverney C，Orsini N，de Sousa G，et al．Cadmium-induced apoptosis through the mitochondrial pathway in rainbow trouthepatocytes:Involvement of oxidative stress［J］．Aquatic Toxicology，2004，69(3):247-258

［36］ Chen L，Xu B，Liu L，et al．Cadmium induction of reactive oxygen species activates the mTOR pathway，leading to neuronal cell death［J］．Free Radical Biology and Medicine，2011，50(5):624-632

［37］ Long Y，LiQ，Li J，et al．Molecular analysis，developmental function and heavy metal-induced expression of ABCC5 in zebrafish［J］．Comparative Biochemistry and Physiology B:Biochemistry and Molecular Biology，2011，158(1):46-55

［38］ Zenzes M T，Krishnan S，Krishnan B，et al．Cadmiun accumulation in follicular fluid ofwomen in vitro fertilization embryo transfer is higher in smokers［J］．Fertility and Sterility，1995，64(3):599-603

［39］ Inoguchi T，Takayanagi R．Role of oxidative stress in diabetic vascular complications［J］．Fukuoka Igaku Zasshi，2008，99(3):47-55

［40］ Kelly K A，Havrilla C M，Brady T C，et al．Oxidative stress in toxicology:Established mammalian and emerging piscinemodel systems［J］．Environmental Health Perspectives，1998，106(7):375-384

［41］ Liochev S I．Reactive oxygen species and the free radical theory of aging［J］．Free Radical Biology and Medicine，2013，60:1-4

［42］ Hsu T，Huang K M，Tsai H T，et al．Cadmium(Cd)-induced oxidative stress down-regulates the gene expression of DNA mismatch recognition proteins MutS homolog 2(MSH2)and MSH6 in zebrafish(Danio rerio)embryos［J］．Aquatic Toxicology，2012，126:9-16◆