生产生物燃料的技术难题

（青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266042）

0 引 言

微生物通过发酵途径可以将碳水化合物转化为醇类、脂肪酸酯、直链烃和环烷烃等生物燃料。微生物法可利用的原料有很多，例如玉米、甘蔗、甜菜棕榈油、植物油、草类和木类等。利用气体原料例如一氧化碳和氢气生产乙醇、醋酸盐、丁酸盐等受到越来越多的关注，例如一些厌氧微生物如产乙酸菌、产甲烷菌等通过Wood-Ljungdahl通路，以CO/CO2和H2为碳源和能源，合成乙酰辅酶A（乙酰辅酶A是重要的中间代谢产物之一，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质），进而进行物质和能量代谢。但是，一氧化碳和氢气难溶于水，所以将其导入发酵液中需要投入大量的财力物力[1]。

1 生产方法中遇到的主要问题

1.1 利用糖类生产乙醇和丁醇

微生物利用单糖或多糖发酵生产乙醇和丁醇是很常见的事，难题在于回收产物、减少污染。例如将乙醇从共沸物中分离出的方法有很多，主要有渗透蒸发、渗透、蒸馏、分子筛吸附等[2]。但是上述方法都需要消耗大量能量 （乙醇重量比从95.6%提纯至99.8%）。其中渗透蒸发和膜渗透的成本相对较低，渗透蒸发的优点是混合物不需要加热到沸腾，所以需要的热能相对较低。分子筛可通过吸附作用将水分吸进分子筛的孔径中，从而去除共沸混合物中的水分，但是分子筛再生阶段会出现大量液体，增加再生困难。

以拜氏梭菌为出发菌株生产丙酮、丁醇的发酵方法（Acetone-Butanol-Ethano），简称 ABE 发酵。在发酵过程中，利用油醇萃取发酵液中的丁醇，萃取之后通过蒸馏便可以得到产物，但是油醇具有一定的毒性，人们还在努力寻找毒性更小的萃取剂，但毒性小的萃取剂萃取丁醇能力有限，所以这也是一个难题。另外一种方法是汽提法，即利用二氧化碳或者是氢气除去挥发性溶剂的方法，需要很大的气流量，增加了生产成本，但这种方法显著的增大了丁醇的产率[3]。

另外，发酵过程中产生的正丁醇和异丁醇不利于微生物的生长，解决方法主要有增强菌株的适应性、发酵过程中使用溶剂泵[4]等，这些方法只是在一定程度上提高了菌株的生产能力，但是发酵液中正丁醇和异丁醇的浓度可分别达到63 g/L和76 g/L，超出了菌株耐受程度，所以最有效的方法还是在发酵过程中及时除去产物醇类，这样就减少了醇类对菌株的毒性、提高产率、减少后处理步骤。

1.2 木质纤维素降解纤维素和半纤维素，转化为糖

发酵之前生物质要进行预处理，在过去的80年已研究出很多预处理的方法[5]。比较常见的就是爆破破碎处理，此法可增加酶和底物的接触面积，减少酶的作用时间，且不会影响葡萄糖的产率。生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其水解产物具有葡萄糖和木糖并存的基本特点。将生物质水解产物转化为液体燃料面临的共性难点问题之一是葡萄糖和木糖并存的原料难以被微生物高效利用，更重要的是，纤维素酶可吸附在木质素上，且此过程为不可逆过程，酶回收时还要移除木质素。基于此，在发酵之前，有必要将纤维素和木质素分离开，目前比较有前景的方法是将生物质溶解在特定的离子液体中，通过加入水或者是其他的抗溶剂使得纤维素沉降下来[6]，而木质素在离子液体中溶解，过滤之后，木质素重新回收，纤维素沉降下来，沉降的纤维素在纤维素酶的水解作用下高效率的转化为糖类，比稀酸处理的生物质的效率还要高[7-8]，目前这种现象的反应机理还不清楚，这种离子液体预处理方法的成本主要在于离子液体本身和回收利用的成本[9]。表面活性剂吐温80可增加酶的溶解性，使酶的使用量减少约60%，很大程度上减少了资金消耗。超声波处理是另一种有效的方法，它可以增大生物质的表面积，增强酶的水解能力。液氨处理可以使得木质素异构化，这使得酶促反应更好的进行[10-11]。

在糖化和水解同时进行的发酵模式中，水解过程中需要高浓度的固体以得到足够量的糖类[12]，但是这会导致溶液粘度增大，搅拌困难[13]。用硫酸预处理的原料，可以高产率发酵得到高浓度的乙醇（＞4%～6%)。在高固体浓度条件下，预处理过程和酶的水解过程还需要进一步的探讨。预处理的成本在整个发酵过程中的成本占有一定的比例。

此过程中纤维素酶的用量及酶与生物质的加入比例对发酵成本影响比较大，虽然也有其他活性比较高的真菌，但木霉菌对于纤维素酶来说，是比较经济的菌株[14]。真菌纤维素酶的生产和真菌的生产状态有很大关系，是可以控制的，例如乳糖可诱导纤维素酶的生产，一些二糖如槐二糖、纤维二糖、纤维素水解后的氧化产物也可以诱导纤维素酶的产生[15]。细菌纤维素酶表达水平低，故没有真菌纤维素酶的活性高。大规模发酵生产生物燃料时，要考虑生产成本，还要提高纤维素酶的活性，尤其是糖基化作用对酶活性的影响。

1.3 同步糖化发酵和联合发酵

微生物预处理后的发酵过程和糖化过程在单一容器中进行，即糖化和发酵这两个不同的工艺过程在同一个生物反应器中同时进行的反应方式叫同步糖化发酵(SSF)，这就大大简化了糖化和发酵过程，降低了资金、节约了成本。更重要的是，在大多数的情况下，糖化速率要慢于发酵速率，当糖化过程生成单体糖后，相对快速的发酵反应马上将糖转化为发酵产物，从而使生物反应器中的单体糖的浓度始终保持在最低的水平，这会降低杂菌的感染，提高产物收率。同时，因为较低的糖溶度，在糖化反应中经常发生的产物糖对酶催化反应的抑制作用，得到了有效的控制，从而加快了糖化的速率，这个效果在高温发酵过程中更为明显。

所以现在人们将研究重点放在同步糖化发酵上，真菌纤维素酶的最适作用温度是50.8℃，如果是酵母菌发酵生产乙醇，发酵温度必须在此温度以下以适于酵母菌的生长 （最适温度30℃，最高温度40℃）。真菌发酵中适用的纤维素酶在50.8℃的活性仅是在30.8℃活性的30%[16]，所以这也是一个矛盾的问题。

长期以来，人们一直在寻找一种生物菌种，可以在发酵木质纤维素的同时还生产乙醇或者是其他的产物，这种发酵方式叫做联合发酵（CBP），前提条件是微生物须是嗜热型的。Clostridiales和Thermoanaerobiales菌株在较高温度下具有很强的代谢纤维素的能力，（热纤梭菌分解纤维素的最适温度是70.8℃[17]),但是浓度低于5%时不会生产乙醇。联合发酵在商业上的应用具有一定的优势，因为它在一定程度上节约了成本，但是它建立在一个苛刻的条件上：碳水化合物的浓度达到400 FPU/g，其中90%的原料转化为蛋白质，仅有10%的原料用于转化为乙醇和生物的生长，生产率是400 FPU/L.h有点是整个发酵过程仅需一天半[18]，周期较短。

1.4 藻类生产甘油三酯和脂肪酸

微藻可利用脂类物质例如甘油三酯和脂肪酸生产生物燃料，几乎所有的藻类都将脂类产在细胞中，只有Botryococcus braunii产物分泌至胞外，但是产率极低，故很少应用于工业化。目前，工业上大规模生产的难点就是收集藻类微生物。常见的方法有：离心分离、过滤、化学絮凝，但是化学絮凝成本较高，并且在处理过程中会引入像铝离子这样的污染物[19]。最新的研究进展表明，低浓度的有机碳源（例如醋酸盐、葡萄糖、甘油）会诱导藻类产生一种胞外聚合物附着在微藻表面，形成一种絮状物，这样就很容易的得到微生物，这是一个比较有前景的收集海藻微生物的方法。

另一方面，从完整的藻类细胞中提取脂质是很困难的，因为它和细胞膜紧密相连，需要细胞破碎以最大限度的得到脂质[20]。在这里，从大豆中提取大豆油的方法并不适用，因为藻类的体积小，且细胞壁厚。有研究表明，机械法是最合适的方法，但是消耗的能量高，超过的脂质本身可提供的能量价值。所以藻类生产油脂的项目，还需要建立一个有效的油脂提取回收的方法。

2 展望

植物纤维资源是地球上分布最广、含量最大、品种最多、价格低廉且可再生时间短的有机资源之一，利用可再生的植物纤维资源生产燃料对于缓解能源危机具有重大意义。利用再生资源解决液体燃料是一个国际性大问题，目前还没有实现大规模工业化生产，主要是经济方面的问题[21]。因此，今后应开发预处理新技术，培育价廉高活力的新型纤维素酶及五碳糖和六碳糖同步发酵的新菌种，研发出流程短、效率高和能耗低的生产乙醇新工艺,从而低生物燃料的生产成本，这将是今后科研的主攻方向[22]。

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