利用骨髓基质细胞与丝素蛋白修复缺损髁突软骨的研究进展

张 卫，张 敏

（1.河北北方学院第一临床医学院口腔医学系，河北 张家口 075000；2.张家口教育学院医学系，河北 张家口 075000）

以生物支架材料为核心，结合细胞建立三维空间复合体，一直是组织工程的核心，作为其研究的两大构成元素之一的支架材料为细胞的生长、繁殖、新陈代谢提供支持。现阶段研究较多的有胶原、纤维蛋白、甲壳素等天然材料，也有聚乳酸、聚羟基乙酸等人工合成高分子材料［1］。作为常用材料的丝素蛋白，具有良好的生物相容性及机械特性，在临床各类组织缺损、新型组织工程材料及生物材料的研发及应用方面有更大潜力。作为另一重要组成元素的种子细胞，也从最开始的终末细胞，如软骨细胞、骨细胞，拓展到具有多向分化潜能的干细胞。骨髓基质细胞是成体骨髓中的具有多向分化潜能组织干细胞，在体外，经适宜的诱导环境具有可分化成骨细胞、软骨细胞、神经细胞以及肌肉、肌腱等结缔组织细胞的潜能，其获得容易，受损伤小，逐渐成为近年来组织工程种子细胞研究的热点［2］。

1 丝素蛋白性能

1.1 丝素蛋白的性质

丝素蛋白是蚕体内所分泌的丝液凝固而成，是天然高分子纤维蛋白，由甘氨酸 （gly）、丙氨酸 （ala）和丝氨酸 （ser）等18种氨基酸组成，约占蚕丝质量的80%以上［3］。丝素蛋白本身具有良好的机械性能、理化性质和生物学性能，经过不同处理可以得到不同的形态，如溶液、膜以及纤维等［4］。经长时间研究与应用，利用丝素蛋白膜为载体，丝素蛋白可用于固定化酶和抗体；利用其特殊的多孔性网状膜结构，丝素蛋白具有良好的吸附和缓释功能，可用于药物缓释载体；鉴于丝素蛋白本身优良的生物相容性能，丝素蛋白广泛应于于人造血管及人造皮肤等人造器官的临床应用［5］。长期临床研究表明，丝素蛋白对细胞有良好的吸附作用，对维持细胞功能也有重要作用，其良好的生物相容性和表面活性，独特的三维空间复合结构是也为细胞立体培养提供了天然支架。

1.2 丝素蛋白经改性后在组织工程学中的应用

丝素蛋白结构性质决定了它在组织工程材料中的广泛应用，但由于本身分子结构中的大分子肽链中肽键及不稳定的侧链的存在，影响丝素蛋白的应用。为进一步提高丝素蛋白的表面性能，提高其空间结构稳定性，常采取共混改性、化学接枝改性、化学交联等方法对其进行改性处理［6］。

Gupta等［7］将丝素蛋白溶解于特殊的 “离子溶液”，将成拓扑形状的支架材料用于细胞培养，结果表明其拓扑结构对细胞生长、增殖、分化和表达有影响，但无副作用，该项研究为丝素蛋白作为生物材料提供了多元化的应用前景。Hu等［8］报道了重组类人胶原与丝素蛋白共混支架用于肝组织工程的研究。重组类人胶原加入丝素蛋白共混后，不但亲水性增加，而且保持了原有的机械性能。Meinel等［9］将丝素蛋白进行精－甘－天冬氨酸三肽 （Arg-Gly-Asp，RGD）修饰，并与修饰前的丝素蛋白和胶原作比较，观察体内、体外炎性反应。研究表明，这两种丝素蛋白膜在体外培养条件下可使人BMSCs产生低水平IL-1β和前列腺素E2，而且RGD修饰的丝素蛋白效果更加明显。

蚕丝由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，去掉丝胶蛋白后会降低丝素蛋白的机械属性。Liu等［10］使用去甲二氢愈创木酸作为交联剂使丝素蛋白保持自然的机械属性，在体内和体外比较脱胶后的丝素蛋白和用去甲二氢愈创木酸改性后的丝素蛋白的物理性质和生物相容性，研究发现改性后其机械性能和膨胀性增加，动物实验表明改性后无免疫炎性反应。

2 骨髓基质细胞

以生物支架材料为核心，将选取的种子细胞二者结合形成三维空间复合体，经培养促使种子细胞生长、繁殖，形成与所选取种子细胞本体自身组织结构和生理功能相似的组织，从而修复组织缺损。作为种子细胞的选择，应尽量避免本体自身的免疫排斥反应，最大程度地提高生物安全性，生物稳定性及生物相容性，基于如上考虑，自体软骨细胞在组织工程学的初始阶段，被认为是理想的细胞来源。但是长期研究表明，软骨细胞在体外培养过程中存在扩增能力有限及难以保持其表型的缺点［11］，不能满足研究及实际需要。而骨髓基质细胞这一成体骨髓中的具有多向分化潜能组织干细胞，经适宜的体外诱导环境，即可分化成骨细胞、软骨细胞、神经细胞以及肌肉、肌腱等结缔组织细胞，亦可转分化成心肌细胞、骨骼肌细胞或肌细胞的前体细胞群BMSCs［12］。因其获得容易、受损伤小、具有长时间的体外扩增能力和多向分化的潜能，在体外培养过程中扩增能力强，表型保持能力强等优点逐渐成为近年来组织工程种子细胞研究的热点。在研究中，可以采用把碳、洋红等颗粒吸附于细胞的简单方法，也可采用导入放射性同位素的方法用于细胞群的标记，通过细胞追踪，观察BMSCs在髁突软骨全层缺失区分化为成熟的软骨细胞的程度及修复效果，从而评定BMSCs与丝素蛋白相结合修复缺损的髁突软骨的效果［13］。

在BMSCs向软骨诱导分化的过程中，经常采用的诱导方法包括给与各种物理技术，采用转基因技术、微循环诱导和添加各种化学因子等方法。其中采用各种化学因子诱导的方法诱导效果稳定且成功率明显高于其他几种方法。经常使用的外源性生长因子有TGF－β［14］、IGF-I［15］、BMPs、FGFs等。这些外源性生长因子作为信号物质参与了其中的精细调节，但是在实际操作中，经诱导的细胞脱离了体内的三维立体结构，其生物学行为受到影响，容易发生变异［16］。颞下颌关节作为人体最复杂的关节之一，其解剖结构复杂，功能运动多样，在各种因素的作用下易于发生病变。在如此复杂的解剖环境中，尤其是在病变关节区炎性水解酶和肿瘤坏死因子 （TNF）及白细胞介素-1，6（IL-1，IL-6）的作用下，BMSCs在体外经外源性生长因子定向诱导过程中所形成的特异性细胞基质少，而且细胞生长速度慢，提示细胞的活力降低［17］。以BMSCs在自体软骨细胞基质的诱导下修复山羊缺损的髁突软骨为例，修复后的山羊颞下颌关节髁突软骨面的全层缺失，说明采用经体外各种化学因子诱导的二维培养诱导后的BMSCs在山羊颞下颌关节髁突软骨缺失区难以达到修复目的［18］。在实验组中，由少量的软骨细胞形成的软骨微环境在其中发挥了作用。目前已有实验证实：由少量的软骨细胞形成的软骨微环境在裸鼠体内皮下区及体外培养环境中均可诱导BMSCs形成软骨。周广东等［19］应用BMSC与体外培养的软骨细胞按一定比例 （6∶4或7∶3）混匀并取一定数量细胞注射到裸鼠皮下：实验发现：混合细胞组形成的软骨组织明显较相同数量的单纯软骨细胞组的体积大，且具有较高的蛋白聚糖含量，而单纯BMSCs组仅形成了纤维性组织，在体外培养环境中也得到了类似的结果［20］。基于如上研究，可认为，在其实验中可能存在：①颞下颌关节内的微环境在BMSCs分化方面发挥重要诱导作用；②在颞下颌关节中，关节囊中的滑液及病变关节区炎性水解酶和肿瘤坏死因子 （TNF）及白细胞介素-1，6（IL-1，IL-6）对BMSCs分化有直接的影响作用；③关节囊内的滑液有着营养BMSCs或者诱导BMSCs分化的能力。

综上所述，以组织工程学的技术来修复缺损的骨组织，为临床骨组织缺损的修复提供了新的思路和新途径，对于提高患者生存质量，有着极其重要的作用。但如何提高诱导效率，如何制取可以代替人体骨组织缺损的组织工程学新产品涉及的问题较多，还需进一步研究。

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